Agilent ZORBAX Eclipse AAA Instructions for Use

Význam tématu

Rychlá a citlivá analýza aminokyselin je klíčová pro komplexní charakterizaci proteinových hydrolyzátů, biotechnologický výzkum i QA/QC ve farmaceutickém či potravinářském průmyslu. Automatizované online derivatizace a robustní chromatografické metody umožňují spolehlivou kvantifikaci primárních i sekundárních aminokyselin v komplexních matricích.

Cíle a přehled studie / článku

Článek popisuje protokol využívající sloupce Agilent ZORBAX Eclipse AAA a kombinovanou derivatizaci o-ftalaldehydem (OPA) pro primární aminokyseliny a 9-fluorenylmethylchloroformátem (FMOC) pro sekundární. Cílem je dosáhnout vysoké citlivosti, rozlišení a opakovatelnosti pro analýzu až 24 aminokyselin.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografický systém: Agilent 1100/1200 HPLC s G1312A pumpou (binary/quaternary), DAD (UV/VIS) a/nebo FLD detektorem.
• Kolony: ZORBAX Eclipse AAA 4,6×75 mm (3,5 µm) pro vysoce propustné analýzy a 4,6×150 mm (3,5 a 5 µm) pro vysoké rozlišení, volitelně 3,0×150 mm (3,5 µm) pro FLD.
• Mobilní fáze: A – 40 mM fosfátový pufrát (pH 7,8), B – směs acetonitril:methanol:voda (45:45:10, v/v/v).
• Gradienty optimalizované pro délky 75 mm (celkem 14 min) a 150 mm (26 min) kolony.
• Derivatizace: online nástřik OPA a FMOC automatizovaně v autosampleru (G1313A/G1367).
• Detekce: UV při 338 nm (primární AAs), 262 nm (sekundární), FLD při Ex/Em 340/450 nm s přeladěním na 266/305 nm po 8,5 (15) minutách.

Hlavní výsledky a diskuse

• Rutinní vysokopropustná separace na 75mm sloupci umožňuje kompletní analýzu 24 aminokyselin za 14 minut s dostatečným rozlišením.
• Na 150mm sloupcích (3,5 vs. 5 µm) poskytuje menší částice vyšší účinnost a lepší rozlišení, zejména kritická dvojice lyzin–hydroxyprolin.
• FLD detekce přináší vyšší citlivost pro sekundární AAs; přepínání emisních kanálů umožňuje detekci OPA a FMOC derivátů v jediném běhu.
• Derivatizační vedlejší produkty se projeví jako mělký šum mezi 7–10 minutami; při monitoringu primárních AAs je bez vlivu na kvantifikaci.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost umožňuje kvantifikaci v rozsahu pmol–nmol, vhodné pro stopovou analýzu.
• Rychlé analýzy a jednoduchá příprava mobilních fází podporují vysokou propustnost laboratoře.
• Flexibilita detekce (DAD, FLD, VWD) pokrývá široké spektrum aplikací od proteomiky po potravinářství.
• Vysoká opakovatelnost díky automatizované online derivatizaci a stabilnímu pufrování.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Přechod k RRLC/UHPLC pro ještě kratší analýzy a vyšší účinnost rozlišení.
• Integrace s hmotnostní spektrometrií pro selektivní detekci a multiplexní kvantifikaci.
• Zavádění izotopově značených standardů pro zvýšení přesnosti v pokročilých bioanalytických aplikacích.
• Automatizace a robotizace přípravy vzorků v kombinaci s online derivatizací.

Závěr

Protokol založený na kolonech ZORBAX Eclipse AAA s online derivatizací OPA/FMOC představuje robustní a univerzální postup pro citlivou analýzu aminokyselin v komplexních matricích. Metoda poskytuje výborné rozlišení, krátké doby analýzy a flexibilitu detekce, což ji řadí mezi standardní nástroje QA/QC i výzkumných laboratoří.

Reference

• Agilent Technologies, Application Note 5980-3088EN, June 2008
• Agilent Technologies, Eclipse AAA Technical Note 5980-1193