Performance Comparison of Agilent 1290 Infinity Binary and Quaternary Systems as an MS Front-End

Význam tématu

Flavonoidy tvoří rozsáhlou skupinu rostlinných polyfenolů, běžně se vyskytujících v potravinách (čaj, ovoce, zelenina, víno). Methylace hydroxylových skupin flavonolů zvyšuje jejich metabolickou stabilitu, biologickou účinnost i orální dostupnost. Rozlišení a charakterizace metabolitů vzniklých enzymatickou methylací je klíčová pro pochopení funkcí flavonoid O-methyltransferáz (OMT) v rostlinách i pro vývoj bioaktivních látek v potravinářství a farmacii.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout analytickou strategii pro separaci a identifikaci regioizomerů methylovaných flavonolů. Studie vychází z původní publikace Ma et al. a kombinuje vysoce účinnou ultrarychlou kapalinovou chromatografii (UHPLC) s kvadrupól-časověle-rozlišeným (Q-TOF) hmotnostním spektrometrem.

Použitá metodika a instrumentace

• Enzymatická methylace: kaempferolu a kvercetinu (750 µmol) pomocí rekombinantních OMT (CsFOMT-1, CsFOMT-2, CsCOMT) v přítomnosti SAM, MgCl2 a DTT při 35 °C po dobu 1 h.
• Extraktace: ukončení reakce HCl, extrakce ethylacetátem, odpaření, rozpuštění v methanolu a filtrace (0,22 µm).
• UHPLC–Q-TOF MS: Agilent 1290 Infinity LC s autosamplerem, termostatizovanou kolonkou a detektorem DAD, spojený s Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF MS s dual JetStream ESI.
• Chromatografie: ZORBAX Eclipse Plus C18 (2,1×100 mm, 1,8 µm), gradient 0,5 % kyseliny mravenčí/2 mM formiátu amonného vs. acetonitril, 0–25 min, 0,2 mL/min.
• MS podmínky: ESI pozitivní mód, suchý plyn 300 °C, 8 L/min, kapilární napětí 3 500 V, fragmentor 130 V, referenční ionty m/z 121,0509 a 922,0098.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizované UHPLC podmínky zajistily baseline separaci až deseti methylovaných produktů. Rozlišení regioizomerů bylo podpořeno charakteristickými fragmentačními cestami:

• rDA fragmentace pro lokalizaci methoxy skupiny na A- nebo B-kruhu.
• specifická eliminace CH4 (neutrální ztráta) pro izomery s methylací v polohách C3, C5, C3′, C4′, C7.

U kaempferolu bylo identifikováno tři monomethylované (3-MeK, 5-MeK, 7-MeK) a jeden dimethylovaný izomer (3,7-DMK). Pro kvercetin byly detekovány čtyři monomethylované (3-MeQ, 3′-MeQ, 4′-MeQ, 7-MeQ) a dva dimethylované izomery (3,3′-DMQ, 7,3′-DMQ). Čtyři z těchto sloučenin nebyly dosud v žádné rostlinné matrici potvrzeny.

Přínosy a praktické využití metody

Vyvinutá metoda umožňuje rychlou identifikaci a charakterizaci methylovaných flavonolů s velmi omezeným počtem standardů. Díky vysokému rozlišení UHPLC a přesné měřené hmotnosti Q-TOF MS lze jednoznačně přiřadit methylovaná vazebná místa a strukturu izomerů. Postup je použitelný pro screening OMT aktivity v rostlinných extraktech, pro metabolomické studie i pro vývoj farmaceutických a nutričních doplňků.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření workflow na další třídy flavonoidů (flavanony, chalcony, izoflavony).
• Integrace s hyphenovanými technikami (UHPLC–MS/MS, IMS–MS) pro hlubší strukturální charakterizaci.
• Využití datově-řízených přístupů (strojové učení) pro automatické rozpoznávání fragmentačních vzorů.
• Biochemický výzkum substrátové specific ity OMT pro design cílených enzymů v biotechnologii.

Závěr

Kombinace UHPLC a vysokorozlišujícího Q-TOF MS poskytuje spolehlivou strategii pro separaci a detekci methylovaných flavonolů. Metoda byla úspěšně aplikována na enzymaticky generované izomery kaempferolu a kvercetinu, včetně čtyř dosud nepopisovaných sloučenin. Propracované fragmentační schéma usnadňuje rychlou identifikaci regioizomerů bez potřeby všech standardů.

Reference

1. Ma C.Y., Lv H.P., Zhang X.Z. et al. Anal. Chim. Acta 795 (2013) 15.
2. Middleton E., Kandaswami C., Theoharides T.C. Pharmacol. Rev. 52 (2000) 751.
3. Yang C.S., Wang X., Lu G., Picinich S.C. Nat. Rev. Cancer 9 (2009) 439.
4. Wen X., Walle T. Drug Metab. Dispos. 34 (2006) 1792.
5. Thomas W. Int. J. Mol. Sci. 10 (2008) 5019.
6. Guerrero M.F. et al. J. Pharm. Pharmacol. 54 (2002) 1378.
7. Ma Y.L. et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 11 (1997) 1364.
8. Rijke E.D. et al. J. Chromatogr. A 1112 (2006) 63.
9. ACD/Labs. ChemSpider (www.chemspider.com), přístup 20. 3. 2013.
10. Arišumi K. et al. Mem. Fac. Agr. Kagoshima Univ. 21 (1985) 147.