Systematic SPE Method Development

Význam tématu

Analytická detekce benzodiazepinů v biologických matricích vyžaduje efektivní a selektivní přípravu vzorku. Správný výběr sorbentu a optimalizace SPE protokolu jsou klíčové pro dosažení vysoké recoverie, nízkého šumu chromatogramu a minimalizaci časové náročnosti přípravy.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo systematicky vyvinout SPE metodu na bázi monomerického C8 (Discovery DSC-8 SPE 96-Well Plate) pro extrakci diazepamu a jeho tří hlavních metabolitů (temazepam, oxazepam, desmethyl diazepamu) z kozího séra a porovnat ji s generickou SPE metodou využívající konvenční C18 fázi.

Použitá metodika a instrumentace

• Metoda vývoje SPE:
  
  • Optimalizace podmínek načítání: pH, organické složky
  • Sledování průlomů analytů a mass-balance analýza
  • Profil promývání a eluace: změny % methanolu a pH
  • Validace v reálném matrice (kozí sérum)
• Porovnávaná generická metoda: C18 SPE 96-Well Plate s eluací 100 % methanolem a následnou evaporací a rekonstitucí.
• Instrumentace:
  
  • Discovery DSC-8 SPE 96-Well Plate (100 mg, C8)
  • Conventional C18 SPE 96-Well Plate (100 mg)
  • PlatePrep vakuová maniulka
  • HPLC-UV systém se sloupcem Discovery C18 (5 cm × 4,6 mm, 5 µm), mobilní fáze methanol/10 mM ammonium acetát (45:55, pH 4,5), detekce UV při 240 nm

Hlavní výsledky a diskuse

• Optimální podmínky pro C8 SPE: načtení vzorku pH 7,1 (25 mM ammonium formát), promytí 20 % methanolu (pH 2,75), eluace 60 % methanolu (pH 2,75).
• Recoverie analytů se pohybovaly v rozmezí 90,0–99,9 % s RSD < 3,5 % pro spike 0,5 µg/mL.
• Generická C18 metoda vykázala nižší recoverie (68,5–89,1 %) a vyšší RSD (4–9 %), nutnost odpaření a rekonstituce eluátu.
• Chromatogramy extraktů z C8 fáze prokázaly nízké pozadí a ostrou selektivitu při analytickém běhu do 6 min.

Přínosy a praktické využití metody

• Eliminace evaporace a rekonstituce urychluje přípravu vzorků.
• Zvýšená reprodukovatelnost a citlivost díky slabší retenci a selektivní eluaci na C8.
• Vhodné pro rutinní analýzu benzodiazepinů v klinických a veterinárních laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace do plně automatizovaných SPE platforem pro vysokokapacitní screening.
• Adaptace na další lipofilní látky a komplikované biologické matrice (moč, tkáně).
• Vývoj kombinovaných sorpčních mechanismů (např. C8 + iontová výměna) pro vyšší čistotu extraktů.

Závěr

Systematický přístup k vývoji SPE s monomerickou C8 fází umožnil rychlou, selektivní a robustní extrakci diazepamu a jeho metabolitů z kozího séra. Metoda překonala generickou C18 proceduru v efektivitě, reproducibilitě i jednoduchosti provedení a odstraňuje časově náročné kroky evaporace a rekonstituce eluátu.