Comprehending COVID-19: Mixed-Mode Chromatography for Ion Pairing Free LC-MS of Remdesivir and Remdesivir Triphosphate

Význam tématu

Ve světle pandemie COVID-19 je klíčové mít spolehlivé analytické metody sledování antivirotik a jejich metabolitů v biologických vzorcích. Remdesivir, jako fosforamidátový prodrug, se v buňkách přeměňuje na aktivní triphosfát, jehož kvantifikace pomáhá vyhodnotit farmakokinetiku a účinnost léčby. Tradiční separace nukleotidů využívá silné iontové párování, což ztěžuje přechod na LC-MS bez kontaminace a ztráty citlivosti.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo navrhnout rychlou a jednoduchou LC-MS metodu pro současnou analýzu remdesiviru, jeho nukleosidového metabolitu GS-441524 a aktivního triphosfátu GS-443902 bez použití iontově párovacích činidel. Využili jsme hybridní směsově módní chromatografii na stacionární fázi Atlantis PREMIER BEH C18 AX s mobilní fází založenou na amonium acetátu.

Použitá metodika

Metodika vycházela z mixed-mode reversed-phase/anion-exchange interakcí. Pro separaci byly optimalizovány parametry pH (4,8 vs. 6,8) a obsah organické fáze (40–60 % acetonitrilu). Gradient o délce 4 minut zajišťoval adekvátní retenci i ostré píky pro všechny analyty.

Použitá instrumentace

• LC systém ACQUITY PREMIER Quaternary System
• Detektor PDA ACQUITY PREMIER PDA Detector
• Mass detektor ACQUITY QDa Mass Detector
• Kolona Atlantis PREMIER BEH C18 AX 1,7 μm (2,1 × 50 mm) při 50 °C
• Gradient mobilních fází s IonHance buffer concentráty (amonium acetát pH 6,8, IonHance CX-MS pH 5)

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla retenčních faktorů 1–10 pro remdesivir při 40–60 % acetonitrilu, nezávisle na pH. Vyšší pH (6,8) zlepšilo tvar píků triphosfátu, byť s mírně nižším rozlišením diphosfát/triphosfát. Chromatogramy pro poměry RMD:RTP 10:1 i 1:10 prokázaly dobrou citlivost a rozlišení. Identifikace analyzovaných sloučenin byla potvrzena extrakcí m/z signálů na QDa detektoru.

Přínosy a praktické využití metody

• Bez iontově párovacích činidel – možnost rychlé změny analytických režimů
• Rychlá a snadná příprava mobilních fází z komerčně dostupných koncentrovaných pufrů
• Kompatibilita s UV i MS detekcí
• Vhodné pro in vitro studie, PK/PD analýzy a dávkovací studie

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze dále optimalizovat pro lepší symetrii píků triphosfátu snížením hmotnostního naložení. Při rozšiřování na další polymerázové inhibitory a jejich metabolity v biologických matricích může postup přispět k rychlému screeningu nových antivirotik.

Závěr

Směsově módní kolona Atlantis PREMIER BEH C18 AX v kombinaci s amonium acetátovým mobilním fázím poskytla rychlou, robustní a univerzální platformu pro současnou analýzu remdesiviru a jeho klíčových metabolitů bez potřeby iontového párování. Metoda je perspektivní pro široké spektrum farmakokinetických a in vitro aplikací.

Reference

• Williamson BN et al. Clinical Benefit of Remdesivir in Rhesus macaques Infected with SARS-CoV-2. Nature 2020;585:273–286.
• Warren T et al. Therapeutic Efficacy of GS-5734 against Ebola Virus in Rhesus Monkeys. Nature 2016;531:381–385.
• Walter TH et al. A New Mixed-Mode Reversed-Phase/Anion-Exchange Stationary Phase Based on Hybrid Particles. Waters Application Note 720006742EN;2020.
• Liu C et al. Research and Development on Therapeutic Agents and Vaccines for COVID-19. ACS Central Science 2020;6(3):315–331.
• Amirian ES, Levyb JK. Current Knowledge about Remdesivir (GS-5734) and GS-441524 for Coronaviruses. One Health 2020;9:100128.
• Smith K et al. Utilization of MaxPeak High Performance Surfaces and Atlantis PREMIER BEH C18 AX to Increase LC-MS Sensitivity. Waters Tech Brief 720006745EN;2020.