OVERCOMING PEAK CAPACITY LIMITATIONS IMPOSED BY HYDROGEN EXCHANGE QUENCH CONDITIONS

Význam tématu

Analýza proteinové dynamiky pomocí vodíkové výměnné hmotnostní spektrometrie (HX-MS) je klíčovou metodou v proteomice a strukturní biologii. Nízké pH a teplota, nezbytné pro zastavení výměny vodík–deuterium, výrazně omezují kapacitu chromatografického dělení. Integrování iontové mobility (IMS) do HX-MS workflow nabízí řešení těchto limitací tím, že v plynové fázi odděluje spoluelutující peptidy, čímž rozšiřuje špičkovou kapacitu bez prodloužení chromatografie a zároveň zachovává vysokou míru deuteria ve vzorcích.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl:

• Implementovat IMS do standardního HX-MS protokolu.
• Porovnat sekvenční pokrytí a retenci deuteria při experimentech s a bez IMS.
• Vyhodnotit efekt IMS na kapacitu oddělení komplexních proteinových směsí, včetně velkých modelových proteinů a protilátek.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky podstupovaly kontinuální D2O označování při pokojové teplotě. Po zastavení výměny (pH 2,5, 0 °C) byly proteiny on-line štěpeny pepsinem a separovány RP-UPLC na nanoACQUITY se systémem HDX.
V analyzátoru Waters SYNAPT G2 vybaveném ESI zdrojem probíhalo IMS v argonem tlakovém cellu před detekcí MS.

Použitá instrumentace

• Waters nanoACQUITY UPLC s HDX modulem
• Waters SYNAPT G2 s iontovou mobilitou (IMS) a ESI zdrojem

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání experimentech ukázalo, že:

• Počet identifikovaných peptidů se zvýšil až o 20–30 % při zapojení IMS, aniž by došlo ke snížení deuteria nebo prodloužení cyklu.
• V komplexní směsi dvou proteinů v molárním poměru 1:28 se kapacita špiček výrazně zlepšila – IMS odhalilo další peptidy, které bez mobilitního rozlišení zůstaly skryté.
• Zkrácení LC gradientu při použití IMS umožnilo vyšší retenci deuteria u protilátky (~150 kDa) ve srovnání s prodlouženou separací bez IMS.

Přínosy a praktické využití metody

Implementace IMS do HX-MS přináší následující výhody:

• Rozšířená špičková kapacita chromatografie bez kompromisu v čase analýzy.
• Zvýšené sekvenční pokrytí i u vysoce složitých směsí.
• Možnost použití kratších gradientů, což vede ke snížení ztrát deuteria a zrychlení workflow.
• Efektivní analýza velkých proteinů a protilátek s minimálním množstvím vzorku.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se, že další vývoj IMS technologií a jejich integrace s ultravysoce výkonnými hmotnostními analyzátory přinese:

• Vylepšené rozlišení izobarických a konformačních variant proteinů.
• Rychlejší a citlivější analýzu komplexních proteomických vzorků in vivo.
• Automatizovaná data mining a strojové učení pro interpretaci rozsáhlých IMS-HDX dat.

Závěr

Začlenění iontové mobility do HX-MS pracovního postupu výrazně zvyšuje špičkovou kapacitu a sekvenční pokrytí bez negativního dopadu na retenci deuteria. Metoda poskytuje robustní nástroj pro detailní studium proteinové struktury a dynamiky, zejména při analýze velkých a složitých biologických vzorků.

Reference

1. Wales T.E.; Engen J.R. Mass Spectrom. Rev., 25, 158–170 (2006)
2. Iacob R.E.; et al. Rapid Commun. Mass Spectrom., 22, 2898–2904 (2008)
3. Wales T.E.; et al. Anal. Chem., 80(17), 6815–6820 (2008)
4. Engen J.R.; et al. Encycl. Anal. Chem., Wiley, 2011, ISBN 978047002731
5. Kavan D.; Man P. Int. J. Mass Spectrom., 302, 53–58 (2011)