PROBING SITE-SPECIFIC INTERACTIONS BETWEEN EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR AND AN ADNECTIN USING HDX-ETD MS APPROACH

Význam tématu

Interakce mezi epidermálním růstovým faktorem (EGFR) a specifickými adnectiny představuje klíčový cíl v onkologické terapii. Detailní mapování kontaktního rozhraní na úrovni jednotlivých aminokyselin umožňuje optimalizovat navrhované biologické léky s vyšší afinitou a selektivitou.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo využít kombinaci vodíkové/deuteriové výměnné hmotnostní spektrometrie (HDX-MS) a elektronového přenosu disociace (ETD) k lokalizaci epitope adnectinu na EGFR s vysokým prostorovým rozlišením.

Použitá metodika a instrumentace

V experimentu byly připraveny vzorky lidského EGFR (6,7 mg/ml) a adnectinu (2,3 mg/ml) v poměru 1:2. Označování deuteriem proběhlo v PBS/D₂O během 1 hodiny (peptidová úroveň) nebo 30 minut (reziduální úroveň). Quench proběhl pH 2,4 s TCEP a GnHCl. Digestion probíhala online pepsinem při 0 °C a separace na nanoACQUITY UPLC s lineárním gradientem 6 minut.
Instrumentace:

• Waters Synapt G2-S HDMS s funkcí ETD
• Waters nanoACQUITY UPLC s HDX technologiemi
• Front-end glow discharge a stepwave
• Reagent ETD: 1,3-Dicyanobenzen
• Software: PLGS pro kontrolu a DynamX 3.0 pro analýzu HDX/ETD dat

Hlavní výsledky a diskuse

Peptidová analýza odhalila tři oblasti (residua 1–19, 46–53, 96–108) s vyšší deuteriovou výměnou v neupevněné formě EGFR. Cílený ETD na čtyřnásobně nabitý peptid 1–19 lokalizoval významné ochrany deutéria na T15, L17 a Q16 a nečekaně i na sousedních L14 a K13, které nesly částečnou ochranu, což naznačuje rozšířené rozhraní interakce. Závěry z HDX-MS/ETD korelovaly s krystalovou strukturou (1NQL.pdb) a doplňovaly ji o nové kontaktní body.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda HDX-MS ve spojení s ETD nabízí:

• Mapování protein-proteinových rozhraní na úrovni jednotlivých aminokyselin
• Rychlou lokalizaci epitope bez nutnosti mutageneze
• Možnost aplikace v preklinickém vývoji terapeutik a QA/QC biotechnologických produktů

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace HDX-ETD do studia větších proteinových komplexů a membránových receptorů, vývoj rychlejších chromatografických postupů a pokročilých algoritmů strojového učení pro automatizovanou interpretaci HDX-ETD dat otevřou cestu k detailní strukturní charakterizaci biologických léků in situ.

Závěr

Studie prokázala, že kombinace HDX-MS a ETD poskytuje vysoké prostorové rozlišení interakcí EGFR/adnectin na úrovni jednotlivých aminokyselin, rozšiřuje znalosti o kontaktním rozhraní a podporuje vývoj cílených protinádorových terapeutik.

Reference

• Rand et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2011, 22:1784–1793
• Rand et al., Anal. Chem., 2009, 81:5577–5584
• Ramamurthy et al., Structure, 2012, 20:259–269