Applying a Novel Glycan Tagging Reagent, RapiFluor-MS, and an Integrated UPLC-FLR/QTof MS System for Low Abundant N-Glycan Analysis

Význam tématu

Analýza N-glykanů je klíčová pro charakterizaci glykosylace bioterapeutik, která ovlivňuje jejich účinnost, stabilitu a imunogenicitu. Vysoce citlivá detekce minoritních glykoform je nezbytná pro QC a výzkum v biotechnologickém průmyslu.

Cíle a přehled studie

Studie demonstruje kombinaci nového fluorescenčního a MS-aktivního značkovacího činidla RapiFluor-MS s integrovaným UPLC-FLR/QTof MS systémem. Cílem bylo zlepšit citlivost ve FLR a MS detekci, umožnit analýzu nízko abundantních N-glykanů u lidského IgG a myšího IgG1 a získat kvalitní MS/MS spektra pro strukturální elucidaci.

Použitá metodika

Vzorky bioterapeutických proteinů podrobené enzymatické deglykosylaci byly během méně než pěti minut značené činidlem RapiFluor-MS a extrahované pomocí SPE.
Chromatografická separace probíhala na HILIC sloupci při 60 °C se směsí 50 mM ammonium formiátu (pH 4,4) a acetonitrilu podle plynulého gradientu.
MS analýza v kladném ESI módu byla prováděna v režimu vysoké citlivosti (rozlišení ~30 000), data dependent acquisition s optimalizovanými energiemi pro fragmentaci a interní kalibrací LockSpray.

Použitá instrumentace

• GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan Kit
• ACQUITY UPLC H-Class System
• ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide Column (130 Å, 1,7 µm, 2,1×150 mm)
• ACQUITY UPLC FLR Detector
• Xevo G2-XS QTof Mass Spectrometer se StepWave technologií
• UNIFI Scientific Information System v1.7.1

Hlavní výsledky a diskuse

RapiFluor-MS prokázal více než 100× zlepšení citlivosti MS oproti tradičnímu 2-AB značení. U vzorku 0,5 µg lidského IgG byly detekovány glykoformy až při 0,1 % relativní abundanci s konzistentními FLR a MS odpověďmi. MS/MS fragmentace ukázala dominantní štěpení glykosidických vazeb z obou konců řetězce a tvorbu oxoniových iontů.
Analýza myšího IgG1 odhalila nízko abundantní imunogenní glykoformy obsahující NeuGc a alfa-gal epitopy (FA2Gal1Sg1) s diagnostickými ionty m/z 528,2 a 2260,8. U tradičních štítků nebyla možná dostatečná MS/MS charakterizace.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá příprava vzorků (značení do 5 minut)
• Paralelní FLR a vysoce citlivá MS detekce
• Spolehlivá identifikace a kvantifikace minoritních glykoform ve QC bioterapeutik
• Strukturální elucidace vzácných glykanů pomocí MS/MS

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace workflows pro vysokou propustnost v farmaceutické výrobě
• Další optimalizace značících činidel pro rozšíření rozsahu glykanů
• Integrace pokročilé datové analýzy a umělé inteligence pro hlubší interpretaci spekter
• Rozšíření na jiné typy glykosylace a proteomické aplikace

Závěr

Komplexní spojení RapiFluor-MS značení s UPLC-FLR/QTof MS poskytuje výrazně vyšší citlivost a bohatou strukturní informaci pro nízko abundantní N-glykanové formy. Tato metoda představuje robustní přístup pro charakterizaci glykosylace bioterapeutik a může zásadně zlepšit jejich QC a výzkum.

Reference

• Rapid Preparation of Released N-Glycans for HILIC Analysis Using a Novel Fluorescence and MS-Active Labeling Reagent. Waters a New England Biolabs Application Note (p/n 720005275en.)
• GlycoWorks RapiFluor-MS Kit Care and Use Manual (p/n 715004793en.)