Released N-linked Glycan Analysis Using the Glycan Application Solution with UNIFI

Význam tématu

Glykanová analýza hraje klíčovou roli v charakterizaci bioterapeutik, neboť glykosidické modifikace ovlivňují farmakokinetiku, účinnost a imunogenicitu proteinových léčiv.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo demonstrovat dvě cílené workflow pro komplexní profilování a strukturální objasnění N-vázaných glykanů za využití Glycan Application Solution s UNIFI.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorků byly uvolněny N-glykany enzymaticky a značené fluorescenčním činidlem RapiFluor-MS. Chromatografická separace probíhala v HILIC režimu na kolóně ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide (1,7 µm, 2,1×150 mm) při teplotě 60 °C. Detekce byla kombinována fluorescenčním detektorem (ex 265 nm, em 425 nm) a vysokorozlišovacím QTof MS (Xevo G2-XS). Celý proces řídil a vyhodnocoval UNIFI Scientific Information System.

Hlavní výsledky a diskuse

Byly představeny dva workflow:

• Glycan FLR s MS potvrzením – využívá vědeckou knihovnu kalibrovanou v GU (glukózových ekvivalentech) a přesné hmotnosti pro automatizovanou identifikaci a kvantifikaci až 319 glykanových struktur.
• Glycan DDA – data dependent acquisition MS/MS zpracovaná v ion stick formátu a exportovaná do SimGlycan pro detailní strukturální elucidaci fragmentů.

Workflow 1 umožňuje rychlou a robustní kvantifikaci relativního zastoupení glykánů, workflow 2 pak dodává hlubší pohled na strukturu jednotlivých izomerů.

Přínosy a praktické využití metody

Integrovaný UPLC/FLR/QTof systém se vzájemně doplňuje: kombinace citlivého fluorescenčního značení a vysoce přesné MS detekce umožňuje odhalit nízkomolekulární a potenciálně imunogenní glykany, což zvyšuje důvěryhodnost a reprodukovatelnost glykanových analýz v biopharma průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření knihoven glykanů založených na RapiFluor-MS technologie. Dalšími směry jsou automatizace připravy vzorků, integrace umělé inteligence pro predikci struktur a podpora ještě vyššího rozlišení chromatografie a MS/MS analýzy.

Závěr

Glycan Application Solution s UNIFI nabízí dvě flexibilní a integrované workflow pro komplexní analýzu N-glykanů, která spojují citlivost fluorescenční detekce a přesnost MS v jednom prostředí.

Reference

1. Separation of 2-aminobenzamide labeled glycans using hydrophilic interaction chromatography columns packed with 1.7 um sorbent, J. Chrom. B. 878 (2010) 403–408.
2. Rapid Preparation of Released N-Glycans for HILIC Analysis Using a Labeling Reagent that Facilitates Sensitive Fluorescence and ESI-MS Detection, Anal. Chem. 2015, 87(10), 5401–5409.
3. Applying a Novel Glycan Tagging Reagent, RapiFluor-MS, and an Integrated UPLC-FLR/QTof MS System for Low Abundant N-Glycan Analysis, Waters Application Note p/n 720005383EN.
4. UNIFI Scientific Information System, Waters literature p/n 720004686EN.
5. Mattew P. Campbell et al., GlycoBase and autoGU: tools for HPLC-based glycan analysis, Bioinformatics Applications Note, vol. 24, no. 9, 2008, 1214–1216.
6. Biopharmaceutical Platform Solution with UNIFI: A Holistic Workflow for Acquiring, Processing, and Reporting Fluorescent-Labeled Glycans, Waters Application Note p/n 720004619en.