Peptide Isolation Using the Prep 150 LC System

Význam tématu

Preparativní chromatografie peptidů je zásadní pro výrobu vysoce čistých kandidátů pro diagnostiku i terapii. Díky rostoucímu významu peptidových léčiv a pokročilým analytickým metodám je možné efektivně purifikovat synteticky připravené i biologicky odvozené peptidy s vysokou výtěžností a čistotou.

Cíle a přehled studie

Studie představuje využití systému Prep 150 LC od Waters pro izolaci syntetického peptidu po počátečním screeningovém rozlišení na analytickém HPLC. Cílem bylo demonstrovat prediktabilní škálování analytické metody na preparativní formát a optimalizaci sběru frakcí.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek: 14,4 mg hrubého syntetického peptidu (20 aminokyselin, 75% čistota) rozpuštěného v DMSO (7,2 mg/mL).

• Analytická fáze: XBridge C18, 4,6 × 100 mm, 5 μm; průtok 1,46 mL/min; gradient 5–50 % B za 10 min; detekce 220 nm a 280 nm.
• Preparativní fáze: XBridge C18 OBD Prep, 19 × 100 mm, 5 μm; průtok 25 mL/min; gradienty škálované geometricky podle sloupcových objemů.
• Mobilní fáze: 0,1 % trifluoroctová kyselina ve vodě (A) a v acetonitrilu (B).
• Instrumentace: Alliance HPLC System (2998 PDA), Prep 150 LC System (2545 Binary Gradient Module, 2489 UV/Vis, Prep Inject Module, Fraction Collector III), software ChromScope v1.4.1, GHP Acrodisc filtry.

Hlavní výsledky a diskuse

Po počátečním screeningovém gradientu bylo zjištěno ~75% čistoty hrubého peptidu s několika blízce elujicími nečistotami. Aplikací zúženého gradientu (0,33 % změny složení/ml sloupce) se dosáhlo téměř baseline separace cílového peptidu od příbuzných špiček. Studie zatížitelnosti analytického sloupce ukázala optimální injekční objem 10 μL. Geometrické škálování vedlo k injekcím 85 μL a 171 μL na preparativním sloupci, které vykázaly vysokou reprodukovatelnost chromatografických profilů. Pomocí nástroje fraction simulation v ChromScope bylo možné vizuálně upravit a zpřesnit parametry sběru frakcí, což vedlo k zefektivnění sběru a minimalizaci ztrát vzorku. Analýza sbíraných frakcí prokázala velmi vysokou čistotu produktu.

Přínosy a praktické využití metody

• Prediktabilní přechod z analytické na preparativní škálu díky známým objemům systému a geometrii sloupců.
• Úspora vzorku a rozpouštědel díky přesnému nastavení gradientu a sběru frakcí.
• Sjednocené prostředí pro screening i purifikaci s intuitivním ovládáním přes ChromScope.
• Vysoká reprodukovatelnost a snadná optimalizace metod.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace hmotnostní spektrometrie pro selektivní detekci a identifikaci nečistot.
• Automatizace pracovních postupů a kontinuální purifikace peptidů pro vyšší throughput.
• Vývoj nových fází a sloupců přizpůsobených pro peptidové aplikace s vyšším zatížením.
• Rozšíření metody na biologicky komplexnější vzorky a konjugované peptidy.

Závěr

Ukázali jsme, že systém Prep 150 LC je spolehlivým a snadno ovladatelným řešením pro preparativní purifikaci peptidů. Správné škálování gradientu, objemu injekce a použití vizuálních nástrojů v ChromScope vedlo k reprodukovatelné izolaci vysoce čistých peptidových frakcí. Metoda nabízí jednoduchou implementaci v laboratořích zaměřených na vývoj a výrobu peptidických léčiv.

Reference

1. Uhlig T, Kyprianou T, Martinelli FG, Oppici CA, Heiligers D, Hills D, Calvo XR, Verhaert P. The emergence of peptides in the pharmaceutical business: From exploration to exploitation. EuPA OPEN PROTEOMICS 4 (2014) 58–69.
2. Fosgerau K, Hoffmann T. Peptide therapeutics: current status and future directions. Drug Discovery Today 20(1), January 2015.
3. Merrifield RB. Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide. Journal of the American Chemical Society 85(14), 1963, 2149–2154.
4. Jablonski J, Wheat T, Diehl D. Developing Focused Gradients for Isolation and Purification. Waters Technical Note 720002955EN, September 2009.
5. Aubin A, Jablonski J. Prep 150 LC System: Considerations for Analytical to Preparative Scaling. Waters Application Note 720005458EN, July 2015.
6. Aubin A, Jablonski J. Prep 150 LC System: Considerations for Analytical to Preparative Scaling (duplicitní). Waters Application Note 720005458EN, July 2015.