Method Development for the Separation of Sulfated Estrogens by UltraPerformance Convergence Chromatography (UPC2)

Význam tématu

Analýza sulfátových estrogenů v jejich nativní formě zjednodušuje přípravu vzorku, zkracuje dobu analýzy a minimalizuje riziko chyb. Tyto konjugované steroidy jsou klíčové v hormonální substituční terapii i farmaceutickém vývoji, což vyžaduje vysoce selektivní a citlivé chromatografické metody.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a optimalizovat metodu UltraPerformance Convergence Chromatography (UPC2) pro separaci deseti strukturně podobných sulfátových estrogenů. Klíčovým požadavkem bylo dosáhnout rozlišení izobarických párů (RS > 1,5) a výrazně zkrátit čas a náročnost přípravy oproti běžným GC a LC/MS postupům.

Použitá metodika a instrumentace

• Instrumentace: ACQUITY UPC2 System s PDA detekcí (220 nm)
• Kolona: BEH 2-Ethylpyridine 1,7 µm, 2,1×150 mm
• Mobilní fáze A: CO₂ (lékařská kvalita)
• Mobilní fáze B: methanol s 0,3 % isopropylaminu
• Teplota: 20 °C
• ABPR: 4100 psi
• Gradient: 8 %→27 % methanolu za 12 min s reverzním průtokem 1,4→0,9 mL/min
• Objem injekce: 1,5 µL

Hlavní výsledky a diskuse

• Bezúderová příprava: žádná enzymatická hydrolýza ani derivatizace – čisté ředění vzorku.
• Methanol a isopropylamin zajistily úplné eluování i tvar píku.
• Vyšší tlak (4100 psi) a nižší teplota (20 °C) maximalizovaly rozlišení kritických párů (>1,5).
• Reverzní gradient průtoku udržuje téměř konstantní tlak, zvyšuje účinnost a šetří čas.

Přínosy a praktické využití metody

• Redukce celkové doby analýzy o více než 90 % oproti tradičním GC postupu.
• Zjednodušený workflow s menšími nároky na chemikálie a manipulaci.
• Vhodné pro vývoj a kontrolu farmaceutických přípravků, klinické studie i QA/QC laboratoře.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Online spojení s hmotnostní spektrometrií pro vyšší selektivitu a nižší detekční limity.
• Rozšíření na další steroidní konjugáty (glukuronáty, fosfáty).
• Automatizace přípravy vzorků a frakcionace pro isolaci cílových analy­tů.
• Monitorování environmentálních a biomarkerových studií estrogenů.

Závěr

Vyvinutá UPC2 metoda nabízí rychlou, robustní a vysoce selektivní separaci komplexní směsi sulfátových estrogenů bez náročných kroků přípravy. Metoda splňuje kritéria rozlišení izobarických párů a poskytuje výrazné zrychlení analytického procesu.

Reference

1. National Institutes of Health. State-of-the-Science Conference statement: management of menopause-related symptoms. Ann Intern Med. 2005;142(12):1003-13.
2. Ettinger B, Ensrud KE, Wallace R et al. Effects of ultralow-dose transdermal estradiol on bone mineral density. Obstet Gynecol. 2004;104(3):443-51.
3. Prestwood KM, Kenny AM, Kleppinger A et al. Ultra low-dose micronized 17β-estradiol and bone density in older women. JAMA. 2003;290(8):1042-8.
4. Soliman NF, Hillard TC. Hormone replacement therapy in women with past history of endometriosis. Climacteric. 2006;9(5):325-35.
5. USP Monograph. Conjugated Estrogens, USP35-NF30 [5481]. U.S. Pharmacopeial Convention. 2012.