Method Development for the Analysis of Endogenous Steroids Using Convergence Chromatography with Mass Spectrometric Detection

Význam tématu

Precizní a rychlé stanovení endogenních steroidů je klíčové pro vývoj hormonálních terapií a diagnostiku metabolických poruch Steroidní biosyntéza je složitá a produkty mají podobnou strukturu Proto je nezbytná účinná chromatografická separace před hmotnostní spektrometrií Tradiční metody GC/MS vyžadují derivatizaci s časem analýzy okolo 40 minut Metody LC/MS dosahují 4 až 12 minut Cílem je zkrátit dobu analýzy a minimalizovat spotřebu organických rozpouštědel.

Cíle a přehled studie

Studie se zabývá vývojem dvouminutové analytické metody pro simultánní separaci devíti endogenních steroidů za použití konvergenční chromatografie na systému ACQUITY UPC2 ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrií Cílem bylo porovnat různé UPC2 kolony optimalizovat MS parametry a prokázat reprodukovatelnost a linearitu metody pro biologické vzorky.

Použitá metodika a instrumentace

• Systém ACQUITY UPC2 s moduly Sample Manager Column Manager Convergence Chromatography Manager Photodiode Array Detector a Make up Flow Pump
• Hmotnostní spektrometr Xevo TQ MS se splitterem a výživou make up flow Methanol s 2 5 procenty vody a 0 1 procenta NH4 OH
• Testované kolony ACQUITY UPC2 BEH BEH 2-EP CSH Fluoro Phenyl a HSS C18 SB rozměr 3 0 x 50 mm částice 1 7 μm
• Příprava vzorků člověčí plasma po 3 1 acetonitrilové precipitaci a následném doplnění standardů
• UPC2 podmínky gradient 2 na 17 procent modifikátoru v čase dvou minut teplota 40 °C tlak ABPR 1800 psi průtok 3 65 mL min injekční objem 1 μL pro UV screening a 5 μL pro kalibraci
• MS podmínky ESI plus minus kapilární napětí 1 0 kV desolvační teplota 500 °C průtok plynu 750 L h
• Optimalizace MRM přechodů přímou infuzí standardů IntelliStart

Hlavní výsledky a diskuse

• Kolona BEH poskytla nejlepší rychlou separaci všech devíti steroidů během dvou minut odlišení složek s podobnými hmotnostmi
• Optimalizace make up flow pro zvýšení ionizace prokázala výhodu amoniaku NH4 OH v přísadě do methanolu
• Kapilární napětí 1 0 kV desolvační podmínky 500 °C a 750 L h přinášejí nejlepší signály
• Reprodukovatelnost přes 100 injekcí RSD odstupňované mezi 5 6 a 13 7 procenty
• Lineární rozsah 0 98 až 500 ng mL koeficienty determinace r2 nad 0 992 pro všechny analyty
• Spotřeba rozpouštědel a doba analýzy významně nižší oproti konvenčním LC a GC metodám

Přínosy a praktické využití metody

• Zkrácení doby analýzy na dvě minuty pro vysokopropustné linky
• Minimalizace přípravy vzorků bez nutnosti derivatizace
• Nižší spotřeba methanolu a nižší provozní náklady
• Kompatibilita s UV i MS detekcí
• Možnost adaptace pro klinický výzkum a QA QC v průmyslové analytice

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zvýšení citlivosti derivatizací specializovanými činidly
• Rozšíření metody na nižší biologické koncentrace steroidů
• Přenosnost metody na novější detektory a systémy UPC2
• Využití pro screening hormonálních poruch a metabolických studií
• Možnost aplikace na další skupiny lipofilních sloučenin

Závěr

Metoda konvergenční chromatografie na bázi kapalného CO2 poskytuje velmi rychlou separaci endogenních steroidů s výbornou reprodukovatelností linearitou a nízkou spotřebou organických rozpouštědel Díky tomu představuje efektivní a ekologičtější alternativu k tradičním GC MS a LC MS protokolům pro výzkum vývoj i rutinní analýzy

Reference

• Sellers K Rapid analysis of steroid hormones by GC MS using the new Rxi 1ms column Restek Application Note
• Licea Perez H Wang S Szapacs ME Yang E Development of a highly sensitive and selective UPLC MS MS method for the simultaneous determination of testosterone and 5α dihydrotestosterone in human serum to support testosterone replacement therapy for hypogonadism Steroids 2008 73 601 610
• Schwarz E Liu A Randall H Haslip C Keune F Murray M Longo N Pasquali M Use of steroid profiling by UPLC MS MS as a second tier test in newborn screening for congenital adrenal hyperplasia The Utah experience Pediatric Research 2009 66 230 235