Rapidly Monitoring Released N-Glycan Profiles During Process Development Using RapiFluor-MS and the ACQUITY QDa Detector

Význam tématu

Rapidní sledování uvolněných N-glykanů během vývoje výrobního procesu je klíčové pro zajištění konzistence kvality glykoprofilu terapeutických proteinů. Glykanové struktury ovlivňují farmakokinetiku, imunogenicitu a účinnost bioterapeutik, proto se jejich profil monitoruje v rámci kvalitativně orientovaného přístupu Quality by Design.

Cíle a přehled studie / článku

Studie demonstruje využití značky RapiFluor-MS v kombinaci s UPLC metodou a detektorem ACQUITY QDa pro zkrácení doby přípravy a analýzy uvolněných N-glykanů. Cílem je zrychlit procesní kontrolu glykoprofilu při přechodu proteinů z laboratorní fáze do výrobní linky, přičemž je kladen důraz na spolehlivou kvantifikaci a selektivní detekci glykanových forem.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika zahrnuje:

• Uvolnění a označení N-glykanů pomocí činidla RapiFluor-MS, zkracujícího přípravu vzorku na 30 minut
• Chromatografickou separaci pomocí ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide kolony ve dvou režimech: vysoce rozlišující (55 min) a rychlá (10 min)
• Detekci pomocí fluorescence (FLR) a hmotnostního detektoru ACQUITY QDa s vybranou iontovou detekcí (SIR)

Použitá instrumentace:

• ACQUITY UPLC H-Class Bio System
• ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide Columns (2.1×150 mm & 2.1×50 mm)
• ACQUITY UPLC Fluorescence Detector (FLR)
• ACQUITY QDa Detector
• Empower 3 Chromatography Data Software

Hlavní výsledky a diskuse

• Označení RapiFluor-MS zvýšilo fluorescenční signál až 14× a MS signál až 1000× oproti tradičním metodám
• Rychlá 10minutová metoda zachovala většinu selektivity při mírné ztrátě rozlišení
• SIR detekce odhalila a kvantifikovala koelující glykanové formy (např. M5 vs A2G1), což optická detekce nedokáže
• Lineární odezva SIR pro M5 byla prokázána při různých úrovních přidání, s korelací R=0,99
• Simulace bioreaktorového procesu ilustrovala schopnost rychle detekovat změny podílu M5 při konstantní úrovni referenční A2G1

Přínosy a praktické využití metody

• Zkrácení přípravy a analýzy glykanů na 40 minut umožňuje rychlou zpětnou vazbu během vývoje procesů
• Vyšší citlivost a selektivita hmotnostní detekce odstraňuje potřebu extenzivní chromatografie pro každou glykanovou formu
• Metoda je vhodná pro Quality by Design, QC a průmyslové aplikace, kde se vyžaduje vysoká propustnost

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace online glykoanalýzy pro kontinuální monitorování výrobního procesu
• Rozšíření metody na jiné třídy glykosidů a terapeutických proteinů
• Automatizace kroků přípravy vzorku a zpracování dat pro minimalizaci uživatelského zásahu
• Vývoj pokročilých detekčních režimů pro komplexnější glykoprofily

Závěr

Kombinace RapiFluor-MS a ACQUITY QDa detektoru s UPLC umožňuje rychlou, citlivou a selektivní analýzu uvolněných N-glykanů. Metoda nabízí robustní a kvantitativní přístup, který podporuje vývoj i kontrolu kvality glykozilovaných bioterapeutik.

Reference

• Lauber MA, Brousmiche DW, Hua Z, Koza SM, Guthrie E, Magnelli P, Taron CH, Fountain KJ. Rapid Preparation of Released N-Glycans for HILIC Analysis Using a Novel Fluorescence and MS-Active Labeling Reagent. Waters Application Note P/N 720005275EN. 2015.