Analysis of Serum 17-Hydroxyprogesterone, Androstenedione, and Cortisol by UPLC-MS/MS for Clinical Research

Význam tématu

Stanovení adrenálních steroidů v séru je klíčové pro diagnostiku a sledování endokrinních onemocnění. Imunoanalytické metody často trpí zkreslením výsledků v důsledku křížové reaktivity. UPLC-MS/MS přináší vysokou selektivitu a citlivost pro stanovení 17-hydroxyprogesteronu (17-OHP), androstenedionu (A4) a kortizolu i z malých objemů vzorku.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout rychlou, přesnou a vysoce selektivní metodu pro kvantifikaci 17-OHP, A4 a kortizolu v lidském séru vhodnou pro klinický výzkum. Studie popisuje postup extrakce, chromatografickou separaci UPLC a detekci pomocí tandemové hmotnostní spektrometrie (MS/MS).

Použitá metodika

• Liquid-liquid extrakce vzorku: 50 µL séra s interními standardy do methyl-tert-butyl-etheru, odpaření a rehydratace v 45 % methanolu.
• Chromatografie: ACQUITY UPLC HSS T3 kolona (2,1 × 50 mm, 1,8 µm), teplota 60 °C, průtok 600 µL/min, gradient 45–98 % organické fáze v celkovém čase 4,5 minuty.
• MS/MS detekce: Xevo TQ v režimu pozitivní ESI, MRM přechody s optimalizovanými hodnotami napětí a energie kolizí pro kvantifikátory i kvalifikátory.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC System s HSS T3 kolonkou a VanGuard pre‐kolonkou.
• Hmotnostní spektrometr Xevo TQ MS (FWHM MS1 0,7, MS2 0,8).
• TruView Maximum Recovery Vials, MassLynx v4.1 a TargetLynx Application Manager.

Hlavní výsledky a diskuse

• Sensitivita: LOD 0,25 ng/mL, LLOQ 0,5 ng/mL (SNR >3 a >8).
• Linearita: 0,5–300 ng/mL pro 17-OHP, 0,5–500 ng/mL pro kortizol, 0,5–200 ng/mL pro A4 s r2 > 0,997.
• Přesnost: vnitrobatchová i mezibatchová impreciznost < 10 % CV, odchylky < 7,5 % od nominálních hodnot.
• Recovery: > 70 % pro všechny analyty.
• Matrix efekt: potlačení signálu ~10 % (kortizol, A4) a 50 % (17-OHP), korekce izotopově značenými standardy.
• Separační schopnost: chromatografické rozlišení izobarů (11-deoxykortizol, kortikosteron, 21-deoxykortizol) od cílových analytů.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje spolehlivou kvantifikaci klíčových adrenálních steroidů z omezeného objemu séra, zvyšuje přesnost diagnostiky a sledování onemocnění jako kongenitální adrenální hyperplazie (CAH) nebo Cushingův syndrom. Díky krátké době analýzy (4,5 min) je vhodná pro vysokokapacitní laboratoře.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace do klinického workflow pro screening a terapeutický monitoring.
• Rozšíření analyzovaného panelu o další steroidní hormony a metabolity.
• Automatizace extrakce a datové analýzy pro vyšší reproducibilitu a efektivitu.
• Standardizace metodiky napříč laboratořemi pomocí izotopově značených standardů.

Závěr

Vyvinutá UPLC-MS/MS metoda nabízí rychlou, citlivou a vysoce selektivní analýzu 17-OHP, A4 a kortizolu v séru. Splňuje požadavky klinického výzkumu na linearitu, přesnost a selektivitu a je snadno implementovatelná v rutinních laboratořích.

Reference

• Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation. FDA, 2001.