A Qualitative and Quantitative Ion Mobility MS-Enabled, Data-Independent SILAC Workflow

Význam tématu

Metoda SILAC umožňuje přesné kvantitativní porovnání proteinových hladin v buněčných kulturách díky integraci stabilně izotopově značených aminokyselin. Kombinace se spektrometrií iontové mobility a režimem akvizice data-independent (DIA) posouvá schopnost analýzy komplexních vzorků proteomiky na vyšší úroveň, minimalizuje problémy s chimerickými spektry a zvyšuje reprodukovatelnost měření.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo předvést kvalitativní a kvantitativní workflow pro analýzu SILAC značených mutantních embryonálních myších buněk s mutací Jak2 V617F. Studie demonstrovala:

• Metabolické značení buněk lehkou a těžkou formou lysinu.
• Přípravu vzorků trypsinovou digescí a jejich mixování v poměru ~1:1.
• Analýzu pomocí LC/IM-DIA-MS (HDMSE) na hmotnostním spektrometru SYNAPT G2-S.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky byly připraveny z celkových lyzátů pro-B buněk myší s mutací Jak2. Po značení a digestci byly smíchány na základě proteinového titru. Analytická část zahrnovala:

• LC: nanoACQUITY UPLC s trap kolonkou Symmetry C18 (180 μm x 20 mm) a analytickou BEH C18 (75 μm x 150 mm), teplota 35 °C, gradient 3–40 % B/90 min, tok 300 nL/min.
• MS: SYNAPT G2-S, ESI+, HDMSE 50–2000 m/z, střídání nízké (5 eV) a zvýšené energie (25–45 eV), rozlišení 25 000 FWHM, IMS T-Wave (700 m/s, 40 V).
• Software: ProteinLynx Global SERVER s modulem Expression pro vyhledávání a kvantifikaci.

Hlavní výsledky a diskuse

Workflow umožnilo spolehlivou korelaci prekurzorových a produktových iontů podle retenčního času i driftu. Kvantitativní analýza ukázala:

• Profilin-1 identifikovaný z 10 peptidů s RMS chybou 3,2 ppm (prekurzor) a 4,2 ppm (produkt).
• Průměrný přirozený logaritmický poměr lehké/těžké varianty okolo 0,48 (medián 0,47), variabilita ln poměru 0,05.
• 80 % proteinů vykázalo relativní fold-change mezi 0,4 a 0,6 bez dalších normalizačních úprav.

Přínosy a praktické využití metody

Popisované LC/IM-DIA-MS s HDMSE poskytuje:

• Univerzální, bezselektivní akvizici, minimalizující ztrátu informací.
• Vyšší přesnost kvantifikace díky oddělení iontů v iontové mobilitě.
• Automatizovanou datovou analýzu a vizualizaci v ProteinLynx Global SERVER.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření metodiky v oblasti:

• Komplexních buněčných modelů a multi-omických studií.
• Integrace normalizace a pokročilých algoritmů strojového učení.
• Vysokokapacitních analytických platforem pro klinické a farmaceutické aplikace.

Závěr

Workflow kombinující SILAC se spektrometrií iontové mobility a režimem DIA na SYNAPT G2-S prokázal vysokou přesnost, reprodukovatelnost a schopnost analýzy komplexních proteomických vzorků. Tento přístup nabízí výhodnou variantu pro kvantitativní proteomiku s minimem systematických artefaktů.

Reference

• Ong S.E. et al. Mol Cell Proteomics. 2002;1:376-386.
• Houel S. et al. J Proteome Res. 2010;9(8):4152-4160.
• Li J. et al. Proteomics. 2009;9:1696-1719.
• Richardson L. et al. OMICS. 2012;16:468-482.
• Huang S.-T. et al. Anal Chem. 2011;83:6971-6979.
• Geromanos S. et al. Anal Bioanal Chem. 2012;404:1127-1139.