High-Resolution Mapping of Drug Conjugated Peptides in an ADC Digest

Význam tématu

Antibody–drug conjugates představují moderní bioterapeutika kombinující cílenou vazbu monoklonální protilátky s cytotoxickou látkou. Přesná lokalizace a identifikace míst navázání drogy je klíčová pro kontrolu konzistence, bezpečnosti a účinnosti ADC. Vysoce rozlišená peptide mapping analýza umožňuje detekci a charakterizaci konjugovaných peptidů s vysokou citlivostí a reprodukovatelností.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentované aplikace je ukázat optimalizovanou metodu peptide mappingu pro rozlišení a identifikaci peptidů vzniklých konjugací cytotoxické drogy na monoklonální protilátku Trastuzumab. Studie porovnává mapy peptidů pro volnou protilátku a její ADC verzi za účelem odhalení rozdílů odpovídajících konjugovaným peptidům.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek obsahoval trypticky štěpený Trastuzumab a jeho ADC formu. Předenaturace, redukce a alkylace disulfidů byla následována enzymatickým štěpením trypsinem. Chromatografické rozlišení bylo dosaženo na Agilent 1290 Infinity LC systému s AdvanceBio Peptide Mapping kolonou (2,1 × 250 mm, 2,7 μm). Mobilní fáze sestávala z 0,1 % TFA ve vodě a 0,08 % TFA v acetonitrilu. Gradient trval 60 minut při průtoku 0,5 mL/min za teploty 60 °C a detekci na vlnových délkách 210 nm a 252 nm.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace gradientního času a průtoku prokázala, že 60 minut a 0,5 mL/min poskytuje nejvyšší peak capacity až 354. To vedlo k vynikajícímu rozlišení peptidů po celé délce chromatogramu a rychlejší analýze než u kratších kolon. Reprodukovatelnost bylo potvrzena nízkými relativními standardními odchylkami retencí (< 0,2 %) a ploch (< 2 %). Porovnání peptide map mAb a ADC odhalilo novou skupinu pozdně eluovaných peptidů (40–60 minut), odpovídajících hydrofobním drogově konjugovaným fragmentům.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje spolehlivou identifikaci a kvantifikaci drogově navázaných peptidů v ADC. Vysoká rozlišovací schopnost a reprodukovatelnost usnadňuje kontrolu kvality, charakterizaci nových látek a podporuje vývoj stabilnějších a bezpečnějších bioterapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se integrace hmotnostní spektrometrie pro přesnou identifikaci modifikací a rozšíření metodiky na další typy konjugovaných bioterapeutik. Dále je perspektivní vývoj rychlejších sloupců a multi­dimenzionálních chromatografických systémů pro zpracování složitějších vzorků.

Závěr

Vysoce rozlišený peptide mapping na Agilent 1290 Infinity LC a AdvanceBio Peptide Mapping koloně poskytuje robustní nástroj pro charakterizaci ADC. Optimalizované podmínky zajišťují vysokou peak capacity, reprodukovatelnost a schopnost detekovat klíčové konjugované peptidy.

Reference

1. Gudihal R., Waddell K. Identification of Oxidation Sites on a Monoclonal Antibody Using an Agilent 1260 Infinity HPLC-Chip/MS System Coupled to an Accurate-Mass 6520 Q-TOF LC/MS, Agilent Technologies Application Note, 2011
2. Kim M. T. et al. Statistical Modeling of the Drug Load Distribution on Trastuzumab Emtansine a Lysine-Linked Antibody Drug Conjugate, Bioconjugate Chem. 2014, 25, 1223–1232