Improving UPLC-FLR-MS N-glycan Analysis of Disulfide-rich Fusion Proteins Through Optimization of Sample Preparation

Význam tématu

Glykanové profilování fúzních proteinů s vysokým obsahem disulfidických můstků je klíčové pro zajištění kvality a konzistence bioterapeutik. N-glykozylace ovlivňuje farmakokinetiku, účinnost a bezpečnost lékových produktů, proto je třeba spolehlivě uvolnit a detekovat N-glykany pro přesné stanovení jejich struktury a množství.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřila na optimalizaci přípravy vzorku pro analýzu uvolněných N-glykanů u fúzních proteinů bohatých na disulfidické vazby. Hlavním cílem bylo dosáhnout úplného uvolnění glykanů a zkrátit dobu přípravy vzorku.

Použitá metodika a instrumentace

• Kit: Waters GlycoWorks RapiFluor-MS N-glycan Kit s modifikovaným protokolem.
• Denaturace: RapiGest SF s 6 mM TCEP nebo 6,5 mM DTT pro redukci disulfidů.
• Enzym: Rapid PNGase F, 5 minut při 55 °C.
• LC-FLR-MS systém: BioAccord System s UPLC-FLR (λex 265 nm, λem 425 nm) a ACQUITY Glycan BEH Amide kolona.
• MS detektor: ACQUITY RDa, ESI+ režim, m/z 50–2000.

Hlavní výsledky a diskuse

• Integrací TCEP/DTT do denaturačního kroku bylo dosaženo úplné deglykosylace potvrzené RPLC-MS dekonvolucí aglykozylovaných proteinů.
• Optimalizace poměru RFMS štítku vůči proteinu (2×) kompenzovala mírný pokles účinnosti značení v přítomnosti redukčního činidla.
• Identifikováno a kvantifikováno bylo 84 různých glykanů, včetně nízce zastoupených forem (např. Man7 0,08 %).
• Komparativní studie s konvenčním 2-AB značením potvrdila shodu glykanových atributů (fukosylace 98,3 %, sialylace 54,3 %) a zlepšené uvolnění méně přístupných glykanů (G0F).

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá příprava vzorku do 30 min.
• Kompletní uvolnění N-glykanů bez nutnosti alkylace či výměny pufru.
• Zvýšená citlivost detekce FLR a MS pro nízké abundance glykanů.
• Snadný přechod z legacy 2-AB protokolů na moderní RFMS workflow.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření adaptace RFMS-založených protokolů v QC laboratořích farmaceutického průmyslu a vývoj dalších enzymů a štítků pro zvýšení rychlosti, citlivosti a robustnosti glykanové analýzy. Kombinace s pokročilou bioinformatikou umožní detailnější charakterizaci glykoprofilů.

Závěr

Optimalizovaný postup s redukčním činidlem a RapiGest SF dosahuje kompletního uvolnění a účinného značení N-glykanů z disulfid-bohatých fúzních proteinů. Metoda poskytuje rychlou, citlivou a reprodukovatelnou analýzu glykanů vhodnou pro vývoj a kontrolu kvality bioterapeutik.

Reference

1. Strohl WR. Fusion Proteins for Half-Life Extension of Biologics as a Strategy to Make Biobetters. BioDrugs. 2015;29(4):215–239.
2. Higel F, et al. N-glycans of Complex Glycosylated Biopharmaceuticals and their Impact on Protein Clearance. Eur J Pharm Biopharm. 2019;139:123–131.
3. Yu Y. Applying a Novel Glycan Tagging Reagent, Rapi Fluor-MS, and an Integrated UPLC-FLR/QTof MS System for Low Abundant N-Glycan Analysis. Waters Application Note. 2015;720005383EN.
4. Zhang X, et al. Increasing Productivity and Confidence for N-linked Glycan Analysis of Biosimilars Using the BioAccord System. Waters Application Note. 2019;720006545EN.
5. GlycoWorks RapiFluor-MS Quick Start Protocol. 720006992EN.
6. Fang J, et al. Advanced Assessment of the Physicochemical Characteristics of Remicade and Inflectra by Sensitive LC-MS Techniques. MAbs. 2016;8(6):1021–1034.
7. Ruhaak LR, et al. Glycan Labeling Strategies and their Use in Identification and Quantification. Anal Bioanal Chem. 2010;397(8):3457–3481.