Analysis of Polysorbate 80 in IgG Aqueous Solution by Online SPE Using Shim-pack MAYI Column – Part 1

Význam tématu

Polysorbát 80 je surfaktant široce využívaný v proteinových formulacích pro zvýšení rozpustnosti a prevenci agregace makromolekul, zejména imunoglobulinů. Při reverzní fázové HPLC vysoce koncentrovaných proteinových vzorků bez efektivní deproteinizační přípravy dochází k degradaci ODS výplní a k nepřesnostem analýzy. Online odstranění proteinů pomocí sloupce Shim-pack MAYI se hydrofilní povrchovou úpravou umožňuje automatizované přepínání mezi pretrtreatment a analytickou cestou, čímž se prodlužuje životnost analytické kolony a zvyšuje robustnost metody.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace No. L486 je demonstrace kvantitativního stanovení polysorbátu 80 v modelovém roztoku IgG využitím online SPE na Shim-pack MAYI-ODS kolóně spolu s následnou HPLC-MS analýzou. Studie hodnotí efektivitu vyplavení proteinů, linearitu metody, návratnost a opakovatelnost měření v matričním prostředí obsahujícím vysoké koncentrace IgG.

Použitá metodika a instrumentace

Pro deproteinizační předúpravu posloužil sloupec Shim-pack MAYI-ODS (5 mm × 2,0 mm I.D., 50 µm) v kolaboraci se spínacím ventilem a UV detektorem (280 nm). Proteiny jsou blokovány hydrofilním povrchem a vyplaveny během 1 min. Analytická separace polysorbátu 80 probíhá na Kinetex C18 100 Å (50 mm × 2,1 mm I.D., 5 µm) s gradientem 10 mmol/L ammonium formiátu a 2-propanolu. Detekce probíhá na LCMS-2020 (ESI pozitivní, detekční ion m/z 783). Průtoky činí 0,6 mL/min (pretrtreatment) a 0,3 mL/min (separace), injekční objem 1 µL, teplota kolony 40 °C. Systém tvoří tři pumpy, autosampler, UV-detektor a hmotnostní spektrometr.

Hlavní výsledky a diskuse

UV chromatogram potvrdil rychlé vyplavení IgG během prvních 60 s. Standardní roztok polysorbátu 80 (100 µg/mL) vykázal TIC s řadou oligomerních signálů a SIM chromatogram selektivně sledoval ion m/z 783. Metoda prokázala lineární rozsah 10–200 µg/mL se součinitelem determinace R2 > 0,999. V modelovém vzorku (20 mg/mL IgG, 100 µg/mL polysorbátu 80) byla dosažena průměrná návratnost 99 % s RSD 0,034 % (ret. čas) a 1,11 % (plocha), což potvrzuje výbornou opakovatelnost.

Přínosy a praktické využití metody

• Automatizované on-line deproteinizační čištění bez manuálních kroků.
• Ochrana analytické kolony a prodloužení její životnosti.
• Vysoká citlivost a přesnost kvantifikace polysorbátu 80 v proteinových matricích.
• Snadná integrace do QC procesů biofarmaceutické výroby.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Adaptace postupu pro stanovení dalších drobných excipientů v proteinových systémech.
• Kombinace s vysoce rozlišenou hmotnostní spektrometrií pro detailní profilování oligomerů.
• Miniaturizace a zvýšení propustnosti pro vysokovýkonnou analýzu klinických vzorků.
• Využití v klinických farmakokinetických a stabilitních studiích moderních biologických léčiv.

Závěr

Popsaná metoda spojující online SPE s kolónou Shim-pack MAYI-ODS a následnou HPLC-MS analýzu poskytuje spolehlivý, robustní a vysoce citlivý přístup pro stanovení polysorbátu 80 v prostředí vysoce koncentrovaných proteinů. Automatizované přepínání mezi pretrtreatment a analytickým kanálem minimalizuje manuální zásahy a zvyšuje efektivitu rutinní kontroly kvality

Reference

• Shimadzu Application News No. L486 „Analysis of Polysorbate 80 in IgG Aqueous Solution by Online SPE Using Shim-pack MAYI Column – Part 1“, Shimadzu Corporation, 2015.
• Shimadzu Application News No. L285, L286, L293, L305, L307, L315 a L327 – příklady on-line SPE analýzy proteinových vzorků.