Detection of Cocaine and Its Major Metabolites in Rodent Bone Following Outdoor Decomposition after Chronic Cocaine Administration Using the ACQUITY UPLC System with 2D Technology

Význam tématu

Detekce kokainu a jeho hlavních metabolitů v kostech představuje významný posun ve forenzní toxikologii, kde tradiční matrice (krev, moč, měkké tkáně) selhávají po pokročilém rozkladu pozůstatků.
Bone tissue as an alternative matrix allows for long-term uchování stopových koncentrací drogy i po víceletém venkovním rozkladu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout rychlý a citlivý analytický protokol pro kvantifikaci kokainu, benzoylecgoninu a ecgonin methyl esteru v kostech krys po ročním venkovním rozkladu.
Studie zahrnovala chronickou intravenní aplikaci kokainu, obdobie abstinence, opětovnou aplikaci a následné ponechání těl nad zemí po 12 měsíců s následným sběrem kostních vzorků.

Použitá metodika a instrumentace

Homogenizace:

• 0,5 g kostního prášku v 15ml trubici s 4 keramickými kuličkami
• 6000 rpm, 2×90 s, následná centrifugace 4000 rpm/5 min

Extrakce:

• Dvojí extrakce: nejprve methanolem, poté vodou
• Filtrace 0,45 µm PTFE, zředění do 100 ml ultrapure vody (méně než 5 % organiky)

SPE clean-up:

• Oasis MCX 6 cc/150 mg (reverzní fáze/kationtová výměna)
• Praní: voda + HCl, methanol + 2 % kys. mravenčí
• Eluce: 2 ml methanolu s 5 % NH₄OH

2D-LC separace:

• Trapping: Oasis HLB 80 mg, načítání při pH 10 (2 ml/min)
• At-column dilution: MeCN + 0,5 % FA, analytický sloupec ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1×50 mm, 1.7 µm), gradient 5–95 % B/5 min, 0.5 ml/min, 60 °C

MS/MS detekce:

• Xevo TQD, ESI+, dvě MRM tranzice na analyty a deuterované interní standardy
• Optimalizované iontové přechody a kolísací napětí

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace 2D-LC (6×6 mřížka) vyzdvihla najlepšení chromatografie při pH 10 loadingu na 80 mg HLB a eluci MeCN/pH 3.
Extrakční protokol bez odpařování dosáhl 85 % recovery kokainu, 72 % benzoylecgoninu a 54 % ecgonin methyl esteru s LOQ 50 ppt.
Lineární kalibrace v kostních extraktech poskytla R2 ≥ 0.997 pro všechny analyty.
Biologické vzorky z T0 a T2 roky ukázaly detekovatelné koncentrace kokainu a benzoylecgoninu v rozmezí 0,005–0,18 ng/g; ecgonin methyl ester byl detekován jen v referenčním vzorku (vertebrae).

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá příprava vzorku (45 min) bez odpařování
• Citlivost do jednotek ppt
• Robustnost > 1000 injekcí bez významné ztráty výkonu
• Využití v soudně-toxikologických případech s rozloženými těly

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na další psychoaktivní látky a metabolity
• Automatizace homogenizačně-extrakční linky
• Analýza archeologických či dlouhodobě uložených vzorků
• Integrace s nástupci vysokorozlišovací MS

Závěr

Vyvinutý protokol spojující rychlou homogenizaci, micro-SPE a 2D UPLC-MS/MS nabízí účinnou cestu pro detekci kokainu a jeho metabolitů v kostních vzorcích po letech rozkladu. Metoda dokáže přesně kvantifikovat analyty na úrovni ng/g a otevírá nové možnosti v postmrtvní toxikologii.

Reference

1. Mallet CR, Botch-Jones S. J Anal Toxicol. 2016 Aug 25;1–11.
2. Mallet CR. Multi-Dimensional Chromatography Compendium. Waters; 2015.
3. Analysis of Pharmaceuticals and Pesticides in Bottled, Tap and Surface Water Using the ACQUITY UPLC with 2D Technology. Waters; 2014.
4. Waters Corporation Application Note 720005847EN AG-PDF, 2016.