A Guide to Finding Targets that are Expected but not Observed Within a UNIFI Screening Analysis

Význam tématu

Precizní detekce očekávaných cílových látek v komplexních vzorcích je klíčová pro spolehlivou interpretaci dat, ověřování metod a kontrolu kvality ve farmaceutickém i environmentálním sektoru. Screeningové analýzy s využitím přesné hmotnostní spektrometrie umožňují rychlou identifikaci komponent, ale vyžadují optimalizaci parametrů pro minimalizaci falešně negativních nálezů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem dokumentu je objasnit hlavní příčiny, proč se v UNIFI Scientific Information System některé očekávané cíle jeví jako „nepozorované“ nebo proč se nevytváří odpovídající komponenty pro významné neidentifikované vrcholy. Článek popisuje jednotlivé kroky k diagnostice a optimalizaci parametrů analýzy, které vedou k úplnějšímu a spolehlivějšímu výsledku.

Použitá instrumentace

Waters UNIFI® Scientific Information System s moduly Accurate Mass Screening a 3D peak detection pro zpracování LC–ESI–QTOF dat.

Použitá metodika

Workflow zahrnuje:

• Převedení surových dat na seznam kandidátních komponent podle m/z a retenčního času.
• Přiřazení ke knihovně očekávaných cílů s definovanými tolerancemi.
• Řízení alternativních přiřazení, izotopového shlukování a vnitrozdrojových fragmentů.
• Filtrace a omezení počtu kandidátů ve fázích screeningu i discovery.
• 3D detekci vrcholů s možností nastavení prahů intenzity a šířky vrcholů.

Hlavní výsledky a diskuse

• Alternativní přiřazení: přiřazení více cílů ke stejné komponentě může skrýt některé z nich, řešení spočívá ve zobrazení sloupce „Alternate assignments“ a manuální revizi.
• In-source fragmenty vs. odvozené cíle: fragmenty mohou mít přednost před metabolity, aplikace dialogu „In Source Fragments“ umožňuje odstranění chybných přiřazení.
• Tolerance m/z a retenčního času: nepatrné odchylky mohou zabránit přiřazení, doporučuje se explicitní nastavení individuálních tolerancí a filtrování kandidátů v okolí cílové hodnoty.
• Izotopové shlukování: monoisotopový iont může být považován za izotop jiné komponenty, nutné upravit parametry maximálního počtu izotopů v clusteru.
• Omezení počtu kandidátů: sedmdesát tisíc nejintenzivnějších signálů může být redukováno na užší počet pro screening, je potřeba zkontrolovat varování o odstranění a případně zvýšit limity.
• 3D detekce vrcholů: přísné prahy intenzity a filtrování pozadí mohou odstranit slabé, ale reálné signály, doporučuje se úprava parametrů šířky špiček, intenzitního prahu a background filtru.
• Kontrola surových dat: extrakce chromatogramů a vizualizace v 3D Vieweru potvrdí, zda ion vůbec existuje ve spektru.

Přínosy a praktické využití metody

Popsané kroky vedou k výraznému snížení falešně negativních výsledků, usnadňují validaci metod a zkracují dobu potřebnou k manuální kontrole. Laboratoře získají vyšší jistotu v identifikaci stopových látek a metabolitů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření podpory odvozených cílů (metabolitů) ve všech typech screeningových analýz.
• Implementace pokročilých algoritmů strojového učení pro automatickou klasifikaci a rozlišení alternativních přiřazení.
• Vylepšená interaktivní vizualizace 3D dat a automatické návrhy optimalizace parametrů.

Závěr

Optimalizace parametrů UNIFI screeningu je nezbytná pro plnou detekci očekávaných látek. Systém umožňuje detailní diagnostiku chybějících signálů a jejich odstranění úpravou nastavení alternativních přiřazení, tolerancí, izotopového shlukování i parametrů 3D detekce vrcholů.

Reference

1. Goshawk JA, Eatough D, Wood M. Componentization Following 3D-Peak Detection in the UNIFI Scientific Information System. Waters Corporation, p/n 720005480EN, 2016.