Development of a High Sensitivity SPE-LC-MS/MS Assay for the Quantification of Glucagon in Human Plasma Using the ionKey/MS System

Význam tématu

Precizní kvantifikace peptidu glukagonu v lidské plasmě je klíčová pro pochopení patofyziologie diabetu a účinků léčebných postupů. Nízké koncentrace endogenního glukagonu v oblasti pg/mL představují analytickou výzvu, kterou tento přínosný přístup řeší zvýšenou citlivostí a selektivitou.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout vysoce citlivou metodu SPE-LC-MS/MS pro stanovení glukagonu v lidské plasmě s detekčním limitem 12,5 pg/mL a dynamickým rozsahem od 12,5 do 1000 pg/mL. Studie kombinuje selektivní μElution SPE, mikrofluidní chromatografii a ionKey/MS systém se stíněním matrice.

Použitá instrumentace

• ionKey/MS System
• ACQUITY UPLC M-Class System
• ionKey Source
• Xevo TQ-S Mass Spectrometer
• iKey Separation Device (Peptide BEH C18, 130Å, 1.7 μm, 150 μm × 100 mm)
• Oasis MAX 96-well μElution Plate
• MassLynx 4.1 Software
• Waters Collection Plate

Použitá metodika

• Příprava vzorku: Plazma ošetřená proteázovým inhibítorem, acidifikace octovou kyselinou (0,5 %), úprava pH 5% roztokem NH4OH.
• Extrakce SPE: Oasis MAX μElution, kondicionace methanolem a vodou, načtení rozředěného vzorku, dvoufázové mytí a eluční roztok 65 % acetonitril, 25 % voda, 10 % acetic acid.
• Chromatografie: Multidimenzionální UPLC s trap a back-flush elucí, iKey Separation Device při 2,0 μL/min, lineární gradient 15–45 % fáze B.
• Detekce MS/MS: ESI pozitivní režim, MRM přechody 697,1→693,5 (amoniakální ztráta), 697,1→940,2 (b24), 871,5→1040,2 (b26).

Hlavní výsledky a diskuse

Lze dosáhnout LOD 12,5 pg/mL z 200 μL plazmy, lineární rozsah 12,5–1000 pg/mL (r2>0,99). IonKey/MS systém nabídnul 10× zvýšení citlivosti a 4× lepší signál/šum oproti 2,1 mm analytické kolonce při 5 μL injekci. Matrix efekty pro specifické b-ionty <10 %, pro amoniakální ztrátu <15 %. SPE Oasis MAX eliminovala nespecifické pozadí a minimalizovala ztráty peptidu.

Přínosy a praktické využití metody

• Detekce nízkých pg/mL koncentrací glukagonu pro farmakokinetické a biologické studie.
• Nižší spotřeba rozpouštědel (50×) a menší objem vzorku přináší úspory nákladů.
• Rychlá příprava vzorku (<30 min) bez imunoafinity a možnost automatizace.
• Vyšší přesnost, reprodukovatelnost a schopnost multiplexních analýz.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další miniaturizace a integrace mikrofluidních systémů pro analýzu větších biomolekul, rozšíření multiplexních metod pro souběžné stanovení peptidů a proteinů, využití strojového učení pro zpracování MS dat a automatizované platformy pro vysokokapacitní analýzy.

Závěr

Vyvinutá metoda SPE-LC-MS/MS s ionKey/MS systémem pro kvantifikaci glukagonu v lidské plasmě dosahuje vynikající citlivosti, selektivity a reprodukovatelnosti. Umožňuje spolehlivé měření nízkých koncentrací glukagonu při efektivním využití zdrojů a je aplikovatelná v klinickém výzkumu i průmyslové analytice.

Reference

• 1. Eli Lilly and Company Glucagon United States package insert. http://pi.lilly.com/us/rglucagon-pi.pdf
• 2. R&D Systems, Inc. Quantikine ELISA Glucagon Immunoassay DGCG0, 2011.
• 3. EMD Millipore Corporation. Glucagon Chemiluminescent ELISA Kit EZGLU-30K, 2012.
• 4. Millipore. Glucagon RIA Kit GL-32K, 2011.
• 5. ALPCO Diagnostics. Glucagon RIA Plasma, 2011.
• 6. Lapko V. a kol. Exploring quantification of peptides: measurement of glucagon in human plasma by LC-MS/MS, EBF 2010.
• 7. Lapko VN a kol. Sensitive glucagon quantification by immunochemical and LC-MS/MS, Bioanalysis 2013.
• 8. Gerich JE a kol. Effects of physiologic levels of glucagon in human carbohydrate and lipid metabolism, J Clin Invest 1976.