Analysis of Kakkonto by Nexera-e and SPD-M30A Photodiode Array Detector (Part 1)

Význam tématu

Kakkonto je tradiční čínská bylinná směs využívaná pro léčbu nachlazení, bolestí hlavy a ztuhlých šíjových svalů. Obsahuje řadu bioaktivních látek (ephedrin, glycyrrhizová kyselina, cinnamová kyselina), jejichž spolehlivá separace a kvantifikace vyžaduje vysoce výkonné analytické metody. Komplexní dvoudimenzionální kapalinová chromatografie (2D-LC) nabízí zvýšené rozlišení, které nelze dosáhnout jednorozměrnými přístupy.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat použití přístroje Nexera-e v kombinaci s detektorem SPD-M30A pro komplexní 2D separaci extraktu Kakkonta a přesnou kvantifikaci aktivní složky glycyrrhizové kyseliny. Studie hodnotila vliv automatické gradace druhého rozměru na kvalitu separace a prověřila opakovatelnost a lineárnost stanovení.

Použitá metodika a instrumentace

Pro první dimenzi byla zvolena polomikro reverzně-fázová kolona s neutrálním pH mobilní fází, pro druhý rozměr ultra-rychlá reverzně-fázová kolona s kyselým mobilem. Oddělené frakce z první dimenze byly přepínány do druhého rozměru každé 60 s. Aby nedocházelo k deformaci píkového tvaru způsobené změnou složení eluční fáze, byl využit auto-gradient druhého rozměru, který plynule upravuje počáteční a finální koncentrace organického komponentu.

Použitá instrumentace

• Chromatograf Nexera-e (Shimadzu)
• Detektor SPD-M30A Photo diode array, λ = 254 nm
• 1D kolona: Shim-pack XR-ODSⅡ (100 × 1,5 mm, 2,2 µm)
• 2D kolona: Phenomenex Kinetex XB-C18 (50 × 3 mm, 2,6 µm)
• Mobilní fáze 1D: 10 mmol/L fosfátový pufr pH 6,8 / acetonitril, gradient 5→90 % B během 80 min
• Mobilní fáze 2D: 10 mmol/L fosfátový pufr pH 2,6 / acetonitril, gradienty s automatickým přechodem 5→45→5 % a 20→60→20 %
• Průtoky: 1D 0,05 mL/min, 2D 2 mL/min
• Vstřik: 2 µL vzorku, modulační smyčka 50 µL

Hlavní výsledky a diskuse

Implementace auto-gradientu ve druhém rozměru vedla k výraznému zlepšení tvaru a rozlišení píků, což je patrné z porovnání konturových ploch separací s konstantní a plynule měněnou gradací. Glycyrrhizová kyselina byla detekována na 254 nm a kvantifikována ve vzorku extraktu jako 608,4 mg/L.
Opakovatelnost stanovování byla vyhodnocena na pěti replikátech, přičemž relativní standardní odchylka (RSD) retence v celém systému byla 0,007 %, v druhém rozměru 0,37 % a plocha píku 5,4 %. Lineární kalibrační křivka v rozsahu 50–1000 µg/L vykázala R2 = 0,9998.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje vysoce selektivní a reprodukovatelné stanovení klíčových složek v komplexních bylinných extraktech. Hodí se pro rutinní kontrolu kvality (QA/QC) farmaceutických a potravinářských přípravků obsahujících bylinné extrakty.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření 2D-LC na další bioaktivní látky v komplexních matricích
• Kombinace s hmotnostní spektrometrií pro identifikaci neznámých složek
• Další optimalizace automatických gradientních protokolů a zkrácení doby analýzy
• Využití pokročilé softwarové analýzy dat pro rychlou dekonvoluci píků

Závěr

Komplexní 2D kapalinová chromatografie na platformě Nexera-e se SPD-M30A prokázala jako robustní a citlivá metoda pro separaci a kvantifikaci glycyrrhizové kyseliny v extraktu Kakkonta. Použití automatické gradace výrazně zlepšilo kvalitu separace a opakovatelnost výsledků, což metodě dává široký potenciál pro aplikace v analytické praxi.

Reference

Prostudovaná aplikace: Shimadzu Application News LAAN-A-LC-E246A, "Analysis of Kakkonto by Nexera-e and SPD-M30A Photodiode Array Detector (Part 1)", 2014–2015.