Metabolomic Workflow Utilizing Rapid Microbore Metabolic Processing (RAMMP) in Conjunction with SONAR

Význam tématu

Metabolomika poskytuje detailní pohled na malé molekuly v biologických vzorcích a je klíčová pro pochopení fyziologických změn během těhotenství. Rychlé, vysoce selektivní a kvantitativně přesné metody jsou nezbytné pro analýzu velkých souborů vzorků a pro identifikaci potenciálních biomarkerů v různých stadiích těhotenství.

Cíle a přehled studie / článku

Studie si klade za cíl ukázat, že kombinace RAMMP (Rapid Microbore Metabolic Processing) s DIA metodou SONAR poskytuje:

• krátké chromatografické gradienty (3 min) se srovnatelným počtem detekovaných metabolitů jako konvenční delší separace,
• vysokou selektivitu a přesnost kvantifikace v rozsáhlých kohortních experimentech,
• schopnost rozlišit vzorky moče od žen ve 3 trimestru těhotenství.

Použitá metodika a instrumentace

Sample preparation:

• Centrifugace vzorků moče (10 000 g, 10 min), ředění 1:1 s vodou a transfer do skleněných vialek.

LC podmínky:

• ACQUITY UPLC M-Class se BEH C18 kolónou (1 mm×100 mm nebo 300 µm×100 mm, 50 °C).
• Gradient 1–95 % organického činidla za 3, 6 nebo 12 minut, průtok 100 µL/min (1 mm) či 7 µL/min (300 µm).

MS podmínky:

• Xevo G2-XS, ESI (+/–), SONAR DIA 50–1200 m/z, kvadrupólové okno 12 Da.
• Rychlost skenování 0,1 s pro nízkou i vysokou energii, rozlišení 30 000 FWHM.

Bioinformatika:

• Progenesis QI pro zpracování a normalizaci dat.
• EZInfo pro statistiku, Skyline pro cílenou kvantifikaci.

Hlavní výsledky a diskuse

• Počet detekovaných signálů se 300 µm kolónou a 3 min gradientem je ekvivalentní 12 min metodě s 1 mm kolónou.
• PCA jednoznačně rozlišila vzorky moče ze 3 trimestrů bez ohledu na délku gradientu.
• Volkanovy grafy potvrdily stejné diskriminační metabolity v obou režimech.
• SONAR poskytuje velmi selektivní 2D data, snižuje rušení a zvyšuje kvantitativní důvěryhodnost.
• Při 0,1 s skenovací frekvenci bylo dosaženo více než 10 bodů na chromatografický vrchol a reprodukovatelné 2,5-násobné změny koncentrací mezi 1. a 3. trimestru.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysokoprůchodná analýza metabolitů moče s výrazným zkrácením doby běhu.
• Spolehlivé biomarkerové studie pro hodnocení změn během těhotenství.
• Možnost rozšíření workflow na jiné typy biologických vzorků a klinické aplikace.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace rychlých DIA metod s umělou inteligencí a strojovým učením umožní automatizaci analýzy komplexních metabolomických dat. Další miniaturizace kapilárních systémů a zlepšení softwarových nástrojů povede k ještě vyšší citlivosti a robustnosti při studiu dynamických procesů v klinických a farmaceutických aplikacích.

Závěr

Kombinace RAMMP a SONAR DIA nabízí efektivní a vysoce selektivní workflow pro metabolomiku moče. Metoda umožňuje rychlou separaci, konzistentní detekci klíčových metabolitů a přesnou kvantifikaci. Workflow je vhodné pro velké klinické studie a identifikaci biomarkerů.

Reference

1. Gray A. et al. Development of a Rapid Microbore Metabolic Profiling UPLC-MS Approach for High-Throughput Phenotyping Studies. Anal. Chem. 2016;88:5742–51.
2. Want E. et al. Global Metabolic Profiling Procedures for Urine Using UPLC-MS. Nature Protocols. 2010;5:1005–18.