Rapid Microbore Metabolic Profiling (RAMMP) with Ion Mobility for the Lipidomic Investigation of Plasma from Breast Cancer Patients

Význam tématu

Analýza lipidů v biologických vzorcích nabízí zásadní vhled do patofyziologie onemocnění, včetně rakoviny prsu. Prostudování lipidomického profilu velkých kohort pacientů vyžaduje metodiku s vysokou výtěžností, krátkou dobou analýzy a spolehlivou reprodukovatelností. Kombinace rychlé nano-/mikrobore chromatografie s hmotnostní spektrometrií a iontovou mobilitou (RAMMP) představuje inovativní přístup umožňující provádět rozsáhlé studie s přesnými a citlivými detekcemi lipidových biomarkerů.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo nasadit a validovat RAMMP metodiku pro lipidomickou charakterizaci plazmy pacientek s rakovinou prsu ve srovnání se zdravými kontrolami. Studie sledovala zkrácení doby analýzy, zachování chromatografického rozlišení a aplikaci datově nezávislého snímání se zařazením iontové mobility pro zvýšení selektivity a důvěryhodnosti identifikací lipofilních sloučenin.

Použitá metodika

Vzorky plazmy pacientek a kontrol byly smíchány do poolu, denaturovány isopropanolem v poměru 1:4, odcentrifugovány (13 000 rpm, 5 min) a supernatant analyzován.

Chromatografie proběhla na ACQUITY UPLC I-Class s kolonkou ACQUITY BEH C8 (1,0×50 mm, 55 °C), objem injekce 0,2 µL, průtok 250 µL/min. Mobilní fáze A: voda/IPA/MeCN (50:25:25) s 5 mM octanem amonným a 0,05 % kyselinou octovou; fáze B: IPA/MeCN (50:50) se stejnou aditivací. Gradient trval 3,7 min.

MS detekce byla realizována na Synapt G2-Si v režimu ESI+, rozsah 50–1200 m/z, nízká energie 5 eV, vysoká energie 25 eV, kuželové napětí 30 V, sběr dat DIA-HDMS pro měření kolizně-driftových parametrů (CCS).

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC I-Class System
• ACQUITY BEH C8 Column (1,0×50 mm)
• Synapt G2-Si HDMS
• MassLynx Software
• Progenesis QI Software

Hlavní výsledky a diskuse

Geometrické zmenšení kolony a optimalizovaný gradient zkrátily dobu analýzy z 15 na 3,7 min bez ztráty chromatografické kapacity. Porovnání TIC profilů ukázalo, že RAMMP metodika konzervuje rozlišení lipidových tříd (FFA, glycerofosfolipidy, glycerolipidy) obdobně jako konvenční UPLC. Reprodukovatelnost mezi QC vzorky v průběhu dávky byla vysoká.

Metody multivariační analýzy (OPLS-DA) jednoznačně oddělily pacientky s karcinomem prsu od zdravých kontrol. Implementace IMS zvýšila selektivitu, zlepšila spektrální čistotu a umožnila měření CCS hodnot, které byly využity pro spolehlivou identifikaci významných lipidů (např. PC 36:2, LPC 18:0). Diferenciálně exprese lipidů prokazovala sníženou hladinu tri-/diglyceridů a fosfatidylcholinu v plasma u pacientek a zvýšenou expresi fosfatidylserinu.

Přínosy a praktické využití metody

• Zrychlení analýzy až čtyřnásobně s udržením kvality chromatografie
• Vysoká citlivost a robustnost pro velké série vzorků
• Vyšší důvěryhodnost identifikace díky měřeným CCS
• Možnost aplikace v klinických a farmakologických studiích

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace iontové mobility s high-throughput lipidomikou umožní detailnější molekulární fenotypizaci. Dalšími kroky jsou automatizované pracovní postupy, rozšíření na jiné biomolekulární třídy, využití strojového učení pro anotaci dat a nasazení v real-time biomarkerových aplikacích pro personalizovanou medicínu.

Závěr

RAMMP s iontovou mobilitou představuje efektivní platformu pro rychlou lipidomickou analýzu velkých kohort plazmat pacientů. Metoda kombinuje krátký čas běhu, vysokou reprodukovatelnost a přesnou identifikaci klíčových lipidových biomarkerů, což otvírá nové možnosti ve výzkumu onemocnění a klinické diagnostice.

Reference

• 1. Kohno S, Keenan AL, Ntambi JM, Miyazaki M. Lipidomic INSIGHT into cardiovascular diseases. Biochem Biophys Res Commun. 2018;Apr 14.
• 2. Xia J, Wishart DS. Using MetaboAnalyst 3.0 for Comprehensive Metabolomics Data Analysis. Curr Protoc Bioinformatics. 2016;55:14.10.1–14.
• 3. Lewis MR, Pearce JT, Spagou K et al. Development and Application of Ultra-Performance Liquid Chromatography-TOF MS for Precision Large Scale Urinary Metabolic Phenotyping. Anal Chem. 2016;88(18):9004–13.
• 4. Gray N, Adesina-Georgiadis K, Chekmeneva E, Plumb RS, Wilson ID, Nicholson JK. Development of a Rapid Microbore Metabolic Profiling Ultraperformance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Approach for High-Throughput Phenotyping Studies. Anal Chem. 2016;88(11):5742–5.