Sensitive assay of free thyroid hormones by on line SPE-UHPLC-MS/MS in human plasma

Význam tématu

Volné formy tyroxinů T3 a T4 jsou jen zlomek celkového množství těchto hormonů, přesto jejich koncentrace přesně odráží hormonální stav tkání. Kvůli vazbě na plazmatické proteiny je však detekce volných hormonů metodologicky náročná a vyžaduje extrémní citlivost a selektivitu.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout rychlou, vysoce citlivou a reprodukovatelnou metodu pro stanovení volných T3 a T4 v lidské plazmě za pomoci on-line SPE-UHPLC-MS/MS. Reverse T3 (rT3) sloužil jako monitorovací izobar pro ověření selektivity analýzy.

Použitá metodika a instrumentace

Pro oddělení volných hormonů byla nejprve provedena ultrafiltrace plazmy (500 µL) při 2000 g po dobu 20 minut. Filtrát (120 µL) se zpracoval s vnitřními standardy (13C6 analoga, 10 pg/mL) a podal na on-line SPE kolonu Phenomenex STRATA-XC (20×2 mm) kombinující kationtoměnič a hydrofobní interakci. Následovalo přesunutí eluátu do UHPLC (Nexera MP) s kolonou Synergi Fusion-RP C18 (50×2 mm, 2,5 µm) při průtoku 0,4 mL/min. Mřížka gradientu pokrývá 10–100 % organické fáze a celková analýza trvá 8,5 min. Detekce probíhá na LCMS-8040 ve voštinovém MRM režimu (ESI-, negativní režim), sledované přechody pro T3, T4 a rT3.

Hlavní výsledky a diskuse

Lineární kalibrace od 1 do 50 pg/mL s hranicí detekce 1 pg/mL pro oba hormony. Typický pacientský vzorek s hladinami kolem 10 pg/mL vykázal dobře oddělené chromatografické píky pro T3 a T4. Monitorování rT3 potvrzuje, že izobar rT3 nemá vliv na kvantifikaci T3.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá analýza a vysoká propustnost (8,5 min na vzorek).
• Minimální objem plazmy (500 µL) a eliminace vysoce proteinových interferencí.
• Vysoká citlivost a selektivita díky kombinaci on-line SPE a MRM.
• Vhodné pro klinické laboratoře, výzkum i QA/QC aplikace.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření panelu analyzovaných volných hormonů a jejich metabolitů v multiplexním módu. Automatizace a integrace se systémy klinického rozhodování. Aplikace pro monitorování dalších malých biologicky aktivních molekul v komplexních matricích.

Závěr

Navržená on-line SPE-UHPLC-MS/MS metoda umožňuje spolehlivou, citlivou a rychlou kvantifikaci volných tyroidních hormonů v lidské plazmě s minimálními matrix efekty a vysokou reprodukovatelností.

Reference

Maureen Ramero, Stéphane Moreau, Mikaël Levi. Sensitive assay of free thyroid hormones by on line SPE-UHPLC-MS/MS in human plasma. ASMS 2013, WP-098. Shimadzu France SAS, First Edition: June 2013.