Extraction of Thyroid Hormones: T3, rT3 and T4 from Serum Using EVOLUTE® EXPRESS AX Plates Prior to LC-MS/MS Analysis

Význam tématu

Extrahce štítných hormonů T3, rT3 a T4 ze séra je klíčová pro přesné stanovení jejich koncentrací v biomedicínských a klinických aplikacích. Správná předúprava vzorku minimalizuje konverzi hormonů během procesu a odstraňuje rušivé složky matrice, což vede k vyšší citlivosti a spolehlivosti LC-MS/MS analýzy.

Cíle a přehled studie

Publikovaná studie představuje protokol pro selektivní extrakci tri-jodothyroninu (T3), reverzního T3 (rT3) a tyroxinu (T4) ze séra pomocí pevné fáze EVOLUTE EXPRESS AX před jejich kvantifikací metodou LC-MS/MS. Hlavními cíli jsou vysoká reprodukovatelnost, nízký zbytkový obsah fosfolipidů a dosažení kvantifikačních mezí pod 50 pg/mL.

Použitá metodika

Vzorek séra (200 μL) se obohatí interním standardem (D6-T3/rT3) a přidá se směs stabilizátorů (citráty, askorbát, DL-dithiothreitol) k zabránění in vitro konverze T4 na T3/rT3. Následuje SPE protokol:

• Podmínění a ekvilibrace destičky MeOH a vodou
• Nanesení vzorku
• Prvotní proplach 50 mM NH4OAc (pH 9)
• Další proplachy methanolem a 2 % kyselinou mravenčí v DCM
• Eluce analyty v 500 μL methanolu
• Odpaření eluátu při 40 °C a rekonstituce v 50:50 H2O/MeOH (150 μL)

Použitá instrumentace

Pro chromatografii byla použita UPLC soustava s ACE EXCEL2 C18-AR column (2 µm, 100×2,1 mm), mobilní fáze A (2 mM NH4OAc/0,1 % HCOOH) a B (mobilní fáze A s methanolem), průtok 0,4 mL/min. Hmotnostní detektor Xevo TQ-S v módu MRM s ESI v pozitivním ionizačním režimu.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosahuje chromatografické separace T3/rT3 a T4 do 3 minut. Recoveries přesahují 85 % s RSD pod 10 % při koncentraci 2 ng/mL. Kalibrační křivky pro T3 a rT3 vykazují koeficient determinace r2 > 0,99 v rozsahu 25–1000 pg/mL. Díky optimalizaci proplachů a přidání kyseliny v DCM je potlačeno pozadí fosfolipidů a zajištěna čistota extraktu.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená robustnost a reprodukovatelnost stanovení nízkých koncentrací hormonů
• Minimální interferenční vliv fosfolipidů na ionizační zdroj a kolonu
• Vhodné pro klinické laboratoře, QA/QC a farmakokinetické studie

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může zahrnovat automatizaci extrakce na platformách Biotage Extrahera™, využití alternativních sorbentů pro širší panel hormonů a adaptaci metody pro měření hormonálních metabolitů či analogů. Implementace ultrarychlých chromatografických postupů může dále zkrátit analýzu.

Závěr

Vyvinutý protokol pro extrakci hormonů T3, rT3 a T4 pomocí EVOLUTE EXPRESS AX zajišťuje vysokou čistotu vzorku, spolehlivou kvantifikaci a nízké limity detekce. Metoda je rychlá, reprodukovatelná a vhodná pro rutinní i výzkumné nasazení v oblasti endokrinologie.