Development and Validation of Liquid Chromatography-Time of Flight Method of Bacopaside-I and Metabolites for Pharmacokinetic Study

Význam tématu

Bacopa monnieri, známá jako Brahmi, patří mezi rostlinné prostředky tradiční ajurvédské medicíny s potvrzenými kognitivními účinky. Jedním z hlavních aktivních glykozidů je bacopaside I, jehož farmakokinetika a metabolismus dosud nebyly dostatečně prozkoumány kvůli nedostatku citlivých analytických metod. Vyvinutá LC–TOF-MS metoda umožňuje přesnou kvantifikaci bacopaside I a identifikaci jeho metabolitů v biologických matricích, což je klíčové pro vývoj nových léčivých přípravků a validaci dávkovacích režimů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo poprvé navrhnout, optimalizovat a validovat vysoce selektivní a citlivou metodu kapalinové chromatografie v kombinaci s vysokým rozlišením času letu (LCMS-IT-TOF) pro kvantifikaci bacopaside I a zmapování jeho metabolitů v biologických vzorcích (myší moč a stolice). Studie byla rozdělena do tří fází: vývoj chromatografických podmínek, validační testy metodiky a aplikace metody na detekci in vitro a in vivo metabolitů.

Použitá metodika a instrumentace

Pro chromatografii byla použita kolona Kinetex C18 (1,7 µm, 50×2,1 mm) při teplotě 45 °C s gradientním elucečním režimem fází A (voda s 0,1 % kyseliny mravenčí) a B (acetonitril s 0,1 % kyseliny mravenčí) při průtoku 0,3 mL/min. Vzorky moče a stolice byly extrahovány kapalina–kapalina, po sušení a rekonstituci injikovány objemem 10 µL. Hmotnostní spektrometrie probíhala na LCMS-IT-TOF (Shimadzu) v negativním i pozitivním ESI módu (m/z 200–1200) s rozlišením lepším než 5 ppm a kolizní indukovanou fragmentací (CID) za použití argonu.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala lineární odezvu (r2=0,9985) v rozsahu 4,8–380 ng/mL a LOQ pod 4,8 ng/mL. Specifičnost byla zajištěna přesným měřením hmotnosti (<5 ppm). Průměrné zotavení bacopaside I z moče se pohybovalo mezi 91,1 a 107,5 % při třech hodnotách koncentrace, reprodukovatelnost při úrovni LOQ byla 8,7 % RSD. Extrakce ze stolice vykazovala nižší výtěžnost (40–70 %), což naznačuje nutnost další optimalizace. Identifikace metabolitů odhalila sedm kandidátů, z nichž tři hlavní (M1–M3) odpovídají ztrátě glykosidických jednotek při zachovaném pentacyklickém skeletu.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost a selektivita umožňuje přesnou kvantifikaci bacopaside I v komplexních biologických matricích.
• Schopnost simultánního sledování fragmentačních vzorců a přesné hmotnosti usnadňuje identifikaci metabolitů.
• Metoda je vhodná pro farmakokinetické studie a preklinický vývoj nových přípravků na bázi Brahmi.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření metody pro sledování širší škály saponinů z Bacopa monnieri a dalších přírodních zdrojů. Důležitým směrem je optimalizace extrakce ze stolice a biologicky náročnějších vzorků. Implementace LC–TOF-MS do klinických studií by mohla podpořit personalizované dávkování a detekci biomarkerů účinnosti.

Závěr

Studie úspěšně představuje první validovanou LCMS-IT-TOF metodu pro kvantifikaci bacopaside I in vivo a identifikaci jeho metabolitů. Díky vynikající selektivitě a nízkému LOQ poskytuje metodika robustní nástroj pro farmakokinetický výzkum a další vývoj přírodních nootropik.

Reference

• Sookying S., Ingkaninan K. a kol. Development and Validation of Liquid Chromatography-Time of Flight Method of Bacopaside-I and Metabolites for Pharmacokinetic Study. IMSC 2012, PTh-086.