Quantitative Analysis of -Lactam Antibiotics in Human Plasma by High Sensitivity LC/MS/MS Method

Význam tématu

Beta-laktamová antibiotika jsou již dlouhodobě základem léčby širokého spektra bakteriálních infekcí. S narůstající rezistencí bakterií však roste potřeba monitorovat hladiny těchto látek v pacientech a optimalizovat dávkování ve smyslu personalizované medicíny. Konvenční imunochemické metody často trpí nedostatečnou specifitou a zkreslením výsledků křížovou reaktivitou, zatímco LC/MS/MS poskytuje vysokou selektivitu a citlivost.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout rychlou a senzitivní kvantitativní metodu pro pět beta-laktamových antibiotik (meropenem, tazobaktam, piperacilin, cefepim, ceftazidim) v lidské plazmě pomocí MRM-metody na LCMS-8060. Metoda má minimalizovat přípravu vzorku, zkrátit dobu analýzy a zajistit spolehlivou detekci v rozsahu vhodném pro terapeutický monitoring.

Použitá metodika

Vzorky lidské plazmy byly připraveny jednoduchým proteinovým srážením přidáním směsi acetonitril:methanol (1:1) v poměru 3:1 k plazmě. Po 10min vortexu a odstředění byl supernatant filtrovaný přes 0,2 µm nylonový filtr a 2 µl filtru vstříknuto do LCMS-8060. Kvasba kalibrace se prováděla v oblasti 20–4000 ng/ml se stabilně značenými interními standardy.

Použitá instrumentace

• LCMS-8060, triple quadrupole systém s rozehřátou ESI
• Kolona Kinetex C18 1,7 µm, 100×2,1 mm
• Pohyblivá fáze A: voda s 0,1 % kyseliny mravenčí, B: acetonitril s 0,1 % kyseliny mravenčí
• Gradientní eluce 5,5 min; tok 0,5 ml/min; teplota kolony 40 °C
• MRM analýza v pozitivním módu; kolizní plyn Ar 270 kPa; hmotnostní toky N₂ a čistý vzduch pro sušení a ohřev

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizované MRM přechody pro všech pět antibiotik a příslušné IS umožnily odlišení a potvrzení analytů s dostatečnou citlivostí. Lineární kalibrace v rozmezí 20–4000 ng/ml dosáhly koeficientu R2 > 0,997. Limit detekce odhadnutý na poměru S/N = 10 se pohyboval mezi 0,7 a 6,0 ng/ml pro jednotlivé látky. Přesnost (accuracy) byla v rozmezí 87–109 % (výjimkou byla ceftazidim při 20 ng/ml). Opakovatelnost metody (%RSD) byla ve většině případů pod 5 %, obnova (recovery) po srážení proteinů dosáhla hodnot 86–113 %. Matricové efekty byly významné zejména u ceftazidimu (33–40 %) a tazobaktamu (128–149 %) a byly úspěšně sníženy 2,5násobnou ředicí procedurou vodou.

Přínosy a praktické využití metody

Nově vyvinutá metoda přináší následující výhody:

• rychlou analýzu (celkem 5,5 min na vzorek),
• nízkou spotřebu vzorku (2 µl injekce),
• vysokou citlivost a selektivitu vhodnou pro terapeutický monitoring,
• minimální údržbu analytického systému díky malé kontaminaci rozhraní.

Budoucí trendy a možnosti využití

V budoucnu lze metodu rozšířit o další třídy antibiotik a biologicky aktivní látky formou multiplexních panelů. Zavedení automatizované přípravy vzorků, microflow LC a high-resolution MS by mohlo dále zlepšit přenositelnost do rutinních laboratoří i do rychlé klinické diagnostiky. Kombinace s datově řízenou farmakokinetickou modelací otevře cestu k přesnější personalizaci léčby.

Závěr

Vyvinutá LC/MS/MS metoda pro kvantitativní analýzu pěti beta-laktamových antibiotik v lidské plazmě nabízí vysokou citlivost, robustnost a krátký čas analýzy. Díky jednoduché přípravě vzorků a spolehlivým výkonovým parametrům je vhodná pro terapeutický monitoring a farmakokinetické studie v klinickém i výzkumném prostředí.

Reference

1. Shaikh S., Fatima J., Shakil S., Rizvi S. M. D. Antibiotic Resistance: A Review. 2015;22(1):90–101.
2. Grebe S. K., Singh R. J. Clinical Biochemistry Reviews. 2011;32(1):5–31.
3. Berendsen B. LC-MS Residue Analysis of Antibiotics: What Selectivity Is Adequate? 2013.
4. Bhandarkar D. et al. Highly Sensitive Quantitative Analysis of Amoxicillin and Clavulanic Acid from Plasma Using LC/MS/MS. ASMS 2015; TP 280.
5. Colin P., De Bock L., Tjollyn H., Boussery K., Van Bocxlaer J. Talanta. 2013;103:285–293.
6. Barco S. et al. J. Chemotherapy. 2015;27(6):343–347.