High Throughput Screening and Characterization of Bispecifics Using Native Ion Mobility Mass Spectrometry

Význam tématu

Bispecifické protilátky představují novou třídu terapeutických molekul schopných současně vázat dva různé antigeny. Jejich vývoj a analýza jsou náročné vzhledem k heterogenitě výsledných struktur. Native ion mobility hmotnostní spektrometrie (IM-MS) nabízí vysokou rychlost a citlivost pro screening intactních protilátek v přirozeném stavu.

Cíle a přehled studie

Cílem prezentované práce bylo vyvinout a ověřit LC/IM-QTOF metodu pro high throughput screening a charakterizaci bispecifických IgG. Studie demonstruje:

• Přípravu bispecifických protilátek reakcí dvou IgG1 (mAb A a mAb STD) redukovaným glutathionem.
• Analýzu intactních molekul pomocí nanoLC připojeného k Agilent 6560 Ion Mobility Q-TOF.
• Vyhodnocení driftových časů a kolizních průřezů (CCS) pro různé podtřídy IgG.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky vznikly smísením dvou IgG1 v přítomnosti 5 mM glutathionu, inkubací 24 h při 37 °C a následnou výměnou do 100 mM amonného acetátu pH 7.0. Analýza proběhla isokraticky při průtoku 0,4 µl/min. Data byly zpracována v MassHunter Qualitative Analysis s BioConfirm a IM-MS Browser.

Instrumentace:

• Agilent 6560 Ion Mobility Q-TOF s nanoLC rozhraním (G1992A).
• Micro Bio-spin 30 kolony pro buffer exchange.
• Software: MassHunter Qualitative Analysis, BioConfirm, IM-MS Browser.

Hlavní výsledky a diskuse

Native IM-MS umožnila rozlišit jednotlivé podtřídy IgG (IgG1–IgG4) podle driftových časů a kolizních průřezů. Pro bispecifickou směs se objevily dva hlavní konforméry, charakterizované odlišnými CCS. Ramped kolizní energie odhalila specifické fragmenty a potvrdila integritu intactních molekul.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Rychlý screening intactních protilátek bez předchozího štěpení.
• Profilování konformačních stavů a agregátů v rámci jedné analýzy.
• Možnost paralelního zpracování velkého počtu vzorků pro vývoj biotherapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření native IM-MS o:

• Využití alternativních driftovacích plynů pro zlepšení rozlišení konformací.
• Integraci s vysoce výkonnými softwarovými nástroji pro automatizaci analýz.
• Sledování dynamiky výměny Fab domén v reálném čase.

Závěr

Vyvinutá LC/IM-MS metoda poskytuje efektivní cestu pro high throughput screening a detailní charakterizaci bispecifických protilátek. Umožňuje rychlou identifikaci konformačních variant a agregátů, čímž podporuje vývoj nových biotherapeutik.

Reference

• Spiess C, Zhai Q, Carter PJ. Alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies. Molecular Immunology. 2015;67(2):95-106.
• Kontermann RE, Brinkmann U. Bispecific antibodies. Drug Discovery Today. 2015;20(7):838-847.
• Debaene F, et al. Time resolved native ion-mobility mass spectrometry to monitor dynamics of IgG4 Fab arm exchange and “bispecific” monoclonal antibody formation. Analytical Chemistry. 2013;85(20):9785-9792.