Sensitive profiling of IgG1 monoclonal antibody variants under native conditions

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) představují zásadní třídu bioterapeutik, jejichž účinnost a bezpečnost je silně ovlivněna jemnými strukturálními variacemi, včetně glykoform a nabíjecích variant.
Rychlé, citlivé a přímé metody pro analýzu intact proteinů v nativních podmínkách poskytují detailní informace o mikroheterogenitě bez nutnosti denaturace nebo složitého zpracování vzorku.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat výkonnost hmotnostního spektrometru Thermo Scientific Orbitrap Exploris 240 pro analýzu intact mAb v nativních podmínkách za použití separací pomocí SEC a CEX.
Autoři sledovali citlivost, přesnost měření, dynamický rozsah a schopnost detekce nízkoabundantních variant glykoform a nabíjecích variant dvou komerčně dostupných IgG1 mAb (trastuzumab a mAb #2).

Použitá metodika a instrumentace

Chromatografie:

• UHPLC systém Thermo Scientific Vanquish Duo se dvěma Flex Binary Pumpami, Split Samplerem a Column Compartment.
• SEC: MAbPac SEC-1 column (4,0 × 150 mm, 5 µm), 50 mM amonium acetát, 0,3 mL/min, 30 °C, 10 µL injekce.
• CEX: MAbPac SCX-10 RS (2,1 × 50 mm, 5 µm) s pH gradientem – mobilní fáze A: 25 mM amon. hydrogenuhličitan/30 mM octan (pH 5,3), B: 10 mM amon. hydroxid (pH 10,9), 0,4 mL/min, 25 °C, 10 µL.

Hmotnostní spektrometrie:

• Thermo Scientific Orbitrap Exploris 240 s BioPharma Option.
• Rozlišení 30 000 FWHM (@ m/z 200), standardizované tune podmínky pro nativní ESI.

Software:

• Thermo Scientific Xcalibur 4.2 pro řízení a akvizici.
• BioPharma Finder 4.0 se Sliding Window a ReSpect algoritmy pro dekonvoluci.

Hlavní výsledky a diskuse

SEC-MS analýza trastuzumabu při nativních podmínkách prokázala vynikající linearitu, LOD 0,03 µg a LOQ 0,08 µg na kolonce, s dobře rozlišenými nábojovými obálkami (m/z 5000–7000).
CEX-MS analýza mAb #2 umožnila detekci deamidovaných a dalších nabíjecích variant s abundancí pod 3 %, demonstrující vysokou citlivost i pro vzácné mikrovarianty.
Stabilní vysoká kvalita spekter a široký dynamický rozsah usnadňují důvěryhodné profilování mikroheterogenity intact mAb.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda kombinuje jednoduchou přípravu, přímý přenos tune podmínek mezi přístroji a vysokou citlivost, což je výhodné pro:

• ranné fáze vývoje bioterapeutik s omezenou dostupností vzorku,
• monitorování post‐translačních modifikací (deamidace, glykozylace),
• kontrolu kvality a identity mAb ve farmaceutické výrobě.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další vývoj směrem k ještě menšímu množství analyzovaného vzorku, rozšíření separačních technik (např. ion mobility), automatizaci přístupu a integraci do on‐line procesního monitoringu.

Závěr

Orbitrap Exploris 240 představuje robustní platformu pro nativní MS intact mAb, která spojuje vysokou citlivost, přesnost hmotnostního měření a snadnou přenositelnost metod. Umožňuje detailní profilování mikroheterogenity i za nízkých koncentrací vzorku.

Reference

1. Tassi M. et al. Journal of Separation Science 2017, 41, 125–144.
2. Füssl F. et al. Analytical Chemistry 2018, 90(7), 4669–4676.
3. Füssl F. et al. MABS 2018, 11(1), 116–128.