Quantification of Mono and Disaccharides in Foods

Význam tématu

Analýza jednoduchých a složených sacharidů je klíčová pro potravinářský průmysl a regulační orgány. Přesné stanovení fruktózy, galaktózy, glukózy, sacharózy, laktózy a maltózy pomáhá zajistit správné označování přidaného cukru, podporuje ochranu spotřebitelského zdraví a umožňuje plnění požadavků legislativy o potravinových štítcích.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout rychlou, citlivou a selektivní metodu pro stanovení šesti běžných mono- a disacharidů v potravinách a živočišných krmivech. Autoři optimalizovali chromatografické a hmotnostně spektrometrické podmínky v režimu HILIC-UPLC–MS s využitím kolony XBridge BEH Amide XP a detektoru ACQUITY QDa, s důrazem na rozlišení kritického páru galaktóza/glukóza a minimalizaci matricových interferencí.

Použitá metodika

• Příprava standardů a vnitřního standardu: Šestičlenná směs sacharidů (500 mg/L) a stabilně izotopově značené glukózy-13C6 a laktózy-13C6 (1000 mg/L), sedmibodová kalibrace (0,2–100 mg/L) v 1:1 acetonitril/voda.
• Příprava vzorků: Extrakce 0,2–0,5 g vzorku (mléčné produkty, infantní formule, vločky, krmiva, kakao) ethanol-voda, srážení Carrezovými činidly, přidání acetonitrilu, centrifugace, filtrace 0,2 µm a ředění do kalibračního rozsahu.
• Chromatografické podmínky: Kolona XBridge BEH Amide XP (2,5 µm, 3,0×150 mm), teplota 90 °C, mobilní fáze acetonitril:voda:methanol (90:6:4) s 0,05 % diethylaminu a 0,5 mg/L guanidinium chloridu, průtok 0,8 mL/min, objem injekce 1 µL, doba analýzy 25 min.
• Masově spektrometrické podmínky: ACQUITY QDa v režimu ESI negative, monitoring SIR aduktů [M+Cl]− při m/z 215,1; 221,1; 377,1; 383,1 Da, kapilární napětí 0,8 kV, probe 600 °C, rozsah scanu 100–500 m/z.
• Zpracování dat: Empower 3 CDS, kvadratické kalibrační křivky s 1/x vážením (R2 ≥ 0,995), obousměrné vnitřní standardy pro normalizaci signálu.

Použitá instrumentace

• UPLC systém ACQUITY Arc System (Waters Corporation)
• HILIC kolona XBridge BEH Amide XP, 2,5 µm, 3,0×150 mm
• ACQUITY QDa Mass Detector s ESI
• Empower 3 CDS Software

Hlavní výsledky a diskuse

• Selektivita: Baseline oddělení všech šesti sacharidů, včetně galaktózy a glukózy. Koeluce potenciálních isomerů (laktulóza/sacharóza, manóza/galaktóza, cellobióza/laktóza) je v praxi minimální, neboť tyto páry se ve vzorcích běžně nevyskytují.
• Odolnost vůči solím: Přítomnost až 450–500 mM NaCl, NH4HCOO nebo KCl ve vzorcích neměla vliv na tvar a rozlišení píků.
• Kalibrace a linearita: Kvadratické kalibrační křivky s 1/x vážením dosáhly koeficientu determinace R2 ≥ 0,995 pro všechny analyty.
• Přesnost a opakovatelnost: Recoveries 90–125 % při spikování infantních formulí, RSD < 5,8 % při opakovaných měřeních.
• Reálné vzorky: Obsahy sacharidů v různých matricích (ovesné vločky, mléčné prášky, infantní formule, bezlaktózové mléko, kuřecí krmivo, kakao) se pohybovaly v rozmezí 0,08–572 mg/g v závislosti na typu vzorku.

Přínosy a praktické využití metody

• Krátký analytický cyklus 25 minut, přibližně polovina času oproti klasickým HPAEC metodám.
• Vysoká selektivita a citlivost díky SIR detekci a použití izotopově značených vnitřních standardů.
• Minimalizace interferencí matric, čisté chromatogramy bez derivatizace sacharidů.
• Vhodné pro rutinní QA/QC a výzkumné aplikace v potravinářství a krmivářství.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření rozsahu o další sacharidy a oligosacharidy s využitím izotopově značených standardů.
• Integrace s vysokorozlišovacími hmotnostními analyzátory pro identifikaci stopových a neznámých sloučenin.
• Automatizace přípravy vzorků a chromato-mass spektrálního workflow pro vyšší throughput.
• Aplikace v nutrigenomice, sledování glykemického indexu potravin a vývoji nových funkcionalizovaných potravin.

Závěr

Navržená HILIC-UPLC–MS metoda s kolonu XBridge BEH Amide XP a detektorem ACQUITY QDa prokazuje vysokou spolehlivost, selektivitu a rychlost při stanovení šesti klíčových sacharidů v široké škále potravinových a krmivových vzorků. Metoda je ideální pro rutinní analýzy i výzkumné aplikace, kde je důležitá přesnost a minimální vliv matric.

Reference

• Food and Drug Administration. Revision of the Nutrition and Supplement Facts Labels, 21 CFR Part 101, May 27, 2016.
• Benvenuti M., Cleland G., Burgess J. Profiling mono and disaccharides in milk and infant formula using the ACQUITY Arc System and ACQUITY QDa Detector. Waters Application Note 720005767EN, 2016.
• Chavez-Servin J.L., et al. Analysis of mono- and disaccharides in milk-based formulae by high performance liquid chromatography with refractive index detection. Journal of Chromatography A, 2004, 1043(2), 211–215.
• Waters Corporation. XBridge XP 2.5 µm Columns Care and Use Manual, 720004162EN, March 2012.
• Waters Corporation. Occurrence of sugar isomers in food matrices: lactulose, mannose and cellobiose. Application Note, 2019.