Přihlášení
Registrace
Nastavení
Filtrování
Filtrování
Obnova hesla
Obnova hesla
Stanovení cukrů a celkových sacharidů v pivu
St, 18.11.2020
| Originální článek z: Kvasný Průmysl
Metodu stanovení sacharidů pomocí HPLC s RI detekcí na chromatografické koloně s iontovou výměnou v Ag+ cyklu lze využít pro stanovení cukrů i sacharidů v pivu, sladině i mladině.

Pixabay/nastogadka: Stanovení cukrů a celkových sacharidů v pivu

1 ÚVOD

Současná legislativa, Nařízení Evropského parlamentu a požadavky Rady No. 1169/2011 (EU, 2011), ukládá výrobcům potravinářských komodit povinnost informovat spotřebitele o energetickém obsahu jednotlivých druhů potravin a nápojů. Další povinností vyplývající z tohoto nařízení je označovat tzv. nutriční složení potraviny a řady nápojů, jako např. nealkoholického piva. Jedním z významných nutričních parametrů je informace o koncentraci celkových sacharidů a z toho cukrů. Podle definice uvedené v nařízení je:

  • Sacharidy – každý sacharid metabolizovaný člověkem, včetně polyolů
  • Cukry – mono- a disacharidy bez polyolů

To, že je sacharid metabolizován člověkem, znamená, že se jedná o molekulu složenou z molekul glukosy, popřípadě fruktosy vázané α-glykosidickou vazbou. Enzymatický aparát člověka je uzpůsoben právě na štěpení α-glykosidické vazby, za vzniku jednoduchých molekul glukosy, která je zdrojem energie. Nízkomolekulární sacharidy jsou označovány jako cukry a jsou organismem ihned využívány. Proto se někdy označují jako sacharidy a jsou v nutričním označení samostatně vymezeny. Oligosacharidy a polysacharidy jsou energetickým potenciálem pro organismus, ale aby je organismus mohl využít jako energetického zdroje, musí být v trávicím traktu příslušné glykosidické vazby enzymaticky rozštěpeny právě na cukry. Na základě tohoto faktu bylo vydáno Nařízením komise (EU) č. 117/2010 o stanovení obsahu dextrinů (EU, 2010) a Nařízením Komise (EU) č. 900/2008 o analytických metodách a jiných technických ustanoveních nezbytných k provádění režimu vývozu zboží (EU, 2008), které mimo jiné obsahuje povinnost enzymatického štěpení sacharidů s následným stanovením uvolněné glukosy metodou kapalinové chromatografie.

Sacharidy obsažené v pivu pocházejí ze sladu, kde vznikají ve fázi rmutování enzymatickým štěpením. V pivu jsou obsaženy tzv. zkvasitelné cukry jako fruktosa, glukosa a maltosa a sacharid maltotriosa. Ty lze stanovit metodami EBC 8.7, EBC 9.2.7 a MEBAK 2.7.2. (EBC, 2009a; b; MEBAK, 2013a). V poměrně významných koncentracích lze v pivu detekovat také tzv. oligosacharidy (dextriny), což jsou řetězce vzniklé spojením molekul 4 až 10 jednotek glukosy (DP4 – DP10, DP značí zkratku z anglického „degree of polymerization“). Asi jednu třetinu celkové koncentrace sacharidů v pivu tvoří polysacharidy obsahující více jak deset jednotek glukosy. Sumu všech vyjmenovaných sacharidů lze stanovit metodou MEBAK 2.7.3. (MEBAK, 2013b), která je založená na dehydrataci kyselinou sírovou za vzniku 5-hydroxymethylfurfuralu. Ten poskytuje s anthronem barevný produkt stanovovaný kolorimetricky při 625 nm. Tato metoda však nevyhovuje Nařízení komise (EU) č. 117/2010. Podle tohoto nařízení musí být metoda stanovení sacharidů v nápojích a potravinách založena na enzymatické konverzi oligomerů a polymerů sacharidů na glukosu pomocí amylasy nebo amyloglukosidasy, stanovení glukosy musí být provedeno metou HPLC. Jak se ukázalo při vývoji metody (Jurková et al., 2014), účinnost enzymů je negativně ovlivněna přítomností alkoholu. Proto bylo potřeba metodu optimalizovat na maximální možný stupeň konverze. Nerozštěpené oligomery a polymery, zhruba asi 5 % původních sacharidů, jsou pak stanoveny společně s glukosou metodou HPLC s RI (Refractive Index) detekcí.

Stejná instrumentace a HPLC metoda je používaná také pro zjištění původního profilu oligosacharidů do DP10 a glycerolu (polyolu) ve sladině, mladině a pivu, metoda nevyžaduje enzymatické štěpení a vzorek je pouze vhodně naředěn a zfiltrován.

2 METODIKA

2.1 Příprava vzorku - ezymatické štěpení sacharidů

K enzymatickému štěpení oligo- a polysacharidů v pivu se používá amyloglukosidáza z Aspergillus niger (70 units/mg, Sigma Aldrich, Česká republika). Štěpení probíhá ve 100 ml odměrných baňkách vložených do termostatu při teplotě 60 °C po dobu 120 minut. Roztok štěpícího enzymu amyloglukosidasy se přidá k analyzovanému vzorku piva až po vytemperování na požadovanou teplotu 60 °C, od té doby se počítá doba 120 min potřebná k optimálnímu stupni konverze. Po jejím uplynutí je štěpení ukončeno inaktivací enzymu při teplotě 80 °C. Vzorek se odstředí, ochladí na laboratorní teplotu a 10 x zředí ultračistou vodou.

2.2 HPLC stanovení

Pro komplexní analýzu sacharidů piva a sladiny byla použita Rezex RSO - Oligosaccharide kolona s iontovou výměnou v Ag+ cyklu (200×10 mm; Phenomenex, USA). Tato kolona, vyrobená ze sulfonovaného styren-divinylbenzenu se 4 % zesítěním, funguje především jako molekulární síto. Sacharidy a glycerol jsou eluovány v pořadí podle rozměrů molekul, to znamená, že jako poslední jsou eluovány malé molekuly glycerol, fruktosa a glukosa, zatímco oligosacharidy eluují dříve, a to v pořadí sestupném vzhledem ke stupni polymerace (Phenomenex, 2014). Jednotlivé eluující zóny sacharidů jsou pak kvantifi kovány vysoce citlivým refraktometrickým detektorem (Shodex RI – 101).

Mobilní fáze je tvořena pouze ultračistou vodou (Millipore, USA). Její čistota (zejména nízký obsah iontů redukujících kationt Ag+ na neutrální Ag) je důležitá pro dlouhou životnost kolony, neboť vyredukované Ag nenávratně ucpává póry v koloně. Na redukci Ag iontů se podílejí i samotné redukující sacharidy, neboť ve vodné mobilní fázi nastává rovnováha mezi lineární a cyklickou formou, z nichž lineární forma s aldehydickou skupinou je schopna redukovat Ag ionty. Nástřik matrice na kolonu musí být proto omezen na minimum a vzorky jsou před vlastní analýzou většinou ředěny. Kolona je temperována na 85 °C, průtok mobilní fáze je 0,3 ml/min, objem nástřiku je 10 μl. Stanovované analyty jsou glycerol, fruktosa, glukosa, maltosa, oligosacharidy DP3 – DP10.

Pokud analyzovaný vzorek obsahuje sacharózu, v prostředí vodné mobilní fáze a stříbrných iontů kolony při teplotě 85 °C dochází k její úplné degradaci na glukosu a fruktosu. Pro stanovení sacharózy se proto volí separace na NH2 kolonách, kde k tomuto jevu nedochází. Při stanovení sacharidů ve sladině a mladině se původní vzorek musí naředit 50krát, pivo se po odpěnění a odstranění oxidu uhličitého ředí 10krát. K ředění se používá výhradně ultračistá voda s vysokým stupněm deionizace. Zjištěné hodnoty koncentrací zředěných vzorků by se měly nacházet v lineární části kalibrační křivky, jinak je potřeba vzorky více ředit.

Pro přípravu kalibračních roztoků se používají standardy základních cukrů, a to: D(+)-glukosa bezvodá, D(-)-fruktosa a maltosa monohydrát (Merck, Česká republika), a pro stanovení polyolů glycerol (99 %, Sigma-Aldrich, Česká republika). Do 100 ml odměrky se naváží 0,5 g (s přesností 0,1 mg) každého standardu cukru a doplní se po rysku roztokem glycerolu o koncentraci 0,5 g/100 ml. Tento zásobní roztok je dále postupně ředěn deionizovanou vodou tak, aby byly získány kalibrační roztoky v rozsahu koncentrací 0,001 až 0,1 g/100 ml. Maltosa a vyšší oligosacharidy jsou vyhodnocovány podle bezvodé maltosy. Koncentrace pro maltosu jsou proto v kalibraci násobeny koeficientem 0,950002.

Na obr. 1 a 2 je uveden příklad analýzy sacharidů v reálném vzorku nealkoholického piva před a po enzymatickém štěpení. Z jejich porovnání je zřejmý nárůst koncentrace glukosy způsobený více jak 95 % konverzí sacharidů. Jelikož je enzymatické štěpení proces dynamický, v okamžiku jeho přerušení v roztoku zůstávají zbytkové DP oligomery, a i když představují minoritní část, musí být zahrnuty do výpočtu celkového obsahu sacharidů. Při výpočtu celkové koncentrace sacharidů je dále provedena korekce na změnu objemu vzorku přidáním roztoku enzymu (dle použitých objemů) a korekce na účinnost enzymu v závislosti na obsahu alkoholu (tab. 1).

Obr. 1 Chromatogram reálného vzorku nealkoholického piva před enzymatickým štěpením

Obr. 2 Chromatogram reálného vzorku nealkoholického piva po enzymatickém štěpení

Tab. 1 Koeficient výtěžnosti v závislosti na obsahu alkoholu (% obj.)

Účinnost enzymu amyloglukosidasy je pravidelně ověřována pomocí přídavku známé koncentrace maltodextrinu (4 g/100 ml) do nealkoholického piva. Enzymaticky jsou štěpeny původní nealkoholické pivo a nealkoholické pivo s přídavkem maltodextrinu a u obou je změřen celkový obsah sacharidů po štěpení. Rozdíl obou hodnot vyjádřený v procentech vzhledem k hodnotě přídavku maltodextrinu (100 %) vyjadřuje účinnost štěpení.

2.3 Kvantifikace oligomerů DP3 až DP10

Vzhledem ke špatné dostupnosti a vysoké ceně standardů oligomerů, jsou koncentrace oligomerů DP3-DP10 vyhodnoceny pomocí standardu maltosy a získané hodnoty koncentrací jsou pak násobeny relativními odezvovými faktory vzhledem k maltose pro jednotlivé oligomery, získané samostatným měřením pro všechny oligomery včetně maltosy metodou standardního přídavku. Pro DP3 byl získán faktor 1,1; pro DP4 1,3. Vzhledem k nízké koncentraci oligomerů DP5 – DP10 a jejich rozpětí odezvových faktorů v úzkém rozmezí 1,4–1,6 byla hodnota faktoru pro tyto analyty aproximována na hodnotu 1,5.

2.4 Výpočty

Pro výpočet koncentrací jednotlivých sacharidů v pivu, sladině nebo mladině, tj. bez enzymatického štěpení, použijeme následující rovnici

c(p, s, m) = cx . d

kde c(p, s, m) je koncentrace jednotlivého sacharidu v pivu, sladině nebo mladině, cx je změřená koncentrace jednotlivého sacharidu a d je příslušné ředění.

Celkový obsah monosacharidů a oligosacharidů DP2 až DP10 v pivu, sladině nebo mladině bez štěpení, je potom součtem zjištěných koncentrací

c(p, s, m) = Σcxi . d

kde c(p, s, m) je koncentrace všech sacharidů v pivu, sladině nebo mladině, cx je změřená koncentrace každého sacharidu a d je příslušné ředění.

Laboratorní postup enzymatického štěpení sacharidů v pivu pro zjištění celkové koncentrace sacharidů, tj. i těch v pivu přítomných ve formě polysacharidů a glycerolu, v sobě zahrnuje kroky, které jsou zohledněny ve výpočtu odpovídajícími korekčními faktory:

cp = Σcxi . d . e / f

kde cp je celkový obsah sacharidů v pivu včetně glycerolu, cxi je změřená koncentrace jednotlivých sacharidů a glycerolu, d je příslušné ředění, e je korekční faktor změny objemu po přídavku roztoku enzymu a f je korekční faktor účinnosti enzymu, jehož hodnota závisí na obs ahu alkoholu v objemových procentech (viz tab. 1).

2.5 Validační parametry

Validační parametry metody, opakovatelnost (r95), limit kvantifikace přístroje (ILOQ), limit kvantifikace metody (MLOQ) a variační koeficient při koncentraci MLOQ a deseti opakováních (CV) je pro jednotlivé sacharidy uveden v tab. 2.

Tab. 2 Validační parametry metody

3 OVĚŘENÍ METODY

Pro ověření správnosti metody bylo použito srovnání celkové koncentrace sacharidů s reálným extraktem piva, který je tvořen právě sacharidy, dále bílkovinami, organickými kyselinami, minerálními látkami a dalšími minoritními sloučeninami (podrobné informace o nutričním složení piva budou zveřejněny v následném článku Olšovská et al: Energetická hodnota piva, který vyjde srpnu 2018).

V tab. 3 je uveden přehled srovnávaných vzorků, 10 nealkoholických (vzorky 1–10) a 10 alkoholických (vzorky 11–20) piv.

Tabulka 3 Srovnání výsledků celkových sacharidů a skutečného extraktu

V nealkoholických pivech byl nalezen obsah celkových sacharidů od 3,07 do 7,53 g/100 ml s odpovídajícím rozpětím extraktu od 3,17 do 7,94 %. To odpovídá 90,5 až 97,9 % skutečného extraktu s průměrnou hodnotou 94,3 %. Obsah celkových sacharidů v alkoholických pivech se pohyboval v rozmezí 3,19 až 4,35 g/100 ml s odpovídajícím extraktem 3,44 až 5,02 %. Sacharidy v těchto alkoholických pivech tedy představují 86,5 až 92,7 %. Vyšší procento sacharidů v extraktu v nealkoholických pivech je způsobeno nižším stupněm prokvašení, procentní obsah ostatních sloučenin je pak nižší než u běžného alkoholického piva. Vzhledem k těmto výsledkům lze konstatovat, že metoda poskytuje správné výsledky (Jurková et al., 2014).

4 APLIKACE METODY, MONITORING CUKRŮ A SACHARIDŮ V ČESKÝCH PIVECH

VÚPS metodiku stanovení cukrů a sacharidů pro nutriční značení piva provádí již od roku 2012, v roce 2013 byla akreditována Českým institutem pro akreditaci podle normy ISO EN 17025, v roce 2014 byla metodika publikována v zahraničním recenzovaném časopise Food Analytical Methods (Jurková et al., 2014) a certifikována Úřadem pro potraviny na Ministerstvu zemědělství ČR. Řada českých pivovarů již rutinně využívá metodu stanovení sacharidů a cukrů pro značení těchto hodnot na etiketách. Získaná data za období 2016 a 2017 byla statisticky zpracována a vyhodnocena.

4.1 Stanovení profilu oligosacharidů ve sladině

Na obr. 3 je profi l sacharidů do DP10, kterou lze provést popsanou HPLC metodou bez předchozího enzymatického štěpení. Tato metoda je vhodná pro určení sacharidického složení sladiny nebo mladiny, zejména z důvodu obsahu zkvasitelných cukrů. Po integraci chromatografických píků uvedeného příkladu získáme hodnoty cukrů a oligosacharidů uvedených v tab. 4. Výsledná koncentrace sacharidů 8,58 g/100 ml udává koncentraci do DP 10.

Obr. 3 Separace dextrinů DP10 ve sladině (bez enzymatického štěpení)

Tab. 4 Hodno ty sacharidů v modelových vzorcích

4.2 Stanovení celkových sacharidů a z toho cukrů v pivu

Pro potřeby stanovení celkových sacharidů a z toho cukrů, zejména pro nutriční značení piva, se používá následující postup. Nejdříve se změří obsah cukrů v pivu bez štěpení, originální pivo se pouze naředí a stanoví se obsah glukosy, fruktosy a maltosy a tyto tři hodnoty se sečtou. Zároveň je stanoven glycerol. Takto získáme hodnotu cukrů. Příklad analýzy je uveden na obr. 1 a příslušné hodnoty jsou uvedeny v tab. 4. V druhém kroku je pivo enzymaticky štěpeno a zhruba 95 % všech sacharidů je převedeno na glukosu. Pomocí HPLC stanovení je zjištěn obsah vzniklé glukosy a připočten obsah zbytkových nerozštěpených sacharidů, čímž získáme hodnotu celkových sacharidů. Příklad HPLC analýzy celkových sacharidů je uveden na obr. 2 a příslušné hodnoty jsou uvedeny v tab. 4.

Z tab. 4 je zřejmé, jak velká část sacharidů s vyšším polymeračním stupněm nad DP10 je v pivu obsažena. Pokud sečteme separované sacharidy v pivu, které nebyl o štěpeno, získáme v našem konkrétním příkladu hodnotu 3,35 g/100 ml. Pokud provedeme enzymatické štěpení, celková hodnota sacharidů je 4,55. Rozdíl mezi těmito hodnotami, tedy 1,20 g/100 ml, je koncentrace sacharidů nad DP10, které, jak je vidět, nelze z nutričního hlediska zanedbat, neboť tvoří 26 % celkové koncentrace sacharidů. Tento rozdíl je platný pro všechna piva, lze konstatovat, že zhruba 30 % tvoří v pivu sacharidy s vyšším stupněm polymerace než DP10.

5 ZÁVĚR

Metodu stanovení sacharidů pomocí HPLC s RI detekcí na chromatografické koloně s iontovou výměnou v Ag+ cyklu lze využít pro stanovení cukrů i sacharidů v pivu, sladině i mladině s následujícími možnostmi využití. První aplikace, která poskytuje informaci o účinnosti rmutování, je stanovení profilu zkvasitelných cukrů a oligosacharidů ve sladině a mladině. V tomto případě je vzorek pouze vhodně naředěn a ihned chromatograficky analyzován. Pokud chceme znát koncentraci cukrů a glycerolu v pivu pro nutriční značení piva, použijeme metodu stejným způsobem. Konečně pro zjištění celkové koncentrace sacharidů v pivu pro nutriční značení provedeme enzymatické štěpení na glukosu a tu pak stanovíme metodou HPLC-RI. Metoda je dobře opakovatelná, má dobrou výtěžnost a v rámci mezilaboratorních testů poskytuje výborné výsledky.

Kvasný průmysl
 

Mohlo by Vás zajímat

Metabolome Analysis of Hydrophilic Metabolites in Saliva Using LCMS™-8060NX Triple Quadrupole Mass Spectrometer

Aplikace
| 2017 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Metabolomika

A Predictive Compound Database Approach to the Tentative Identification and Semiquantitation of Volatile-Phenol Glycosides in Smoke‑Affected Grapes from Wildfires

Aplikace
| 2019 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Discovery of the Potential Marker Compounds for Stored White Tea by a Metabolomics Approach

Aplikace
| 2019 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Potraviny a zemědělství, Metabolomika
 

Podobné články

Stanovení cukrů a celkových sacharidů v pivu
St, 18.11.2020
| Originální článek z: Kvasný Průmysl
Metodu stanovení sacharidů pomocí HPLC s RI detekcí na chromatografické koloně s iontovou výměnou v Ag+ cyklu lze využít pro stanovení cukrů i sacharidů v pivu, sladině i mladině.

Pixabay/nastogadka: Stanovení cukrů a celkových sacharidů v pivu

1 ÚVOD

Současná legislativa, Nařízení Evropského parlamentu a požadavky Rady No. 1169/2011 (EU, 2011), ukládá výrobcům potravinářských komodit povinnost informovat spotřebitele o energetickém obsahu jednotlivých druhů potravin a nápojů. Další povinností vyplývající z tohoto nařízení je označovat tzv. nutriční složení potraviny a řady nápojů, jako např. nealkoholického piva. Jedním z významných nutričních parametrů je informace o koncentraci celkových sacharidů a z toho cukrů. Podle definice uvedené v nařízení je:

  • Sacharidy – každý sacharid metabolizovaný člověkem, včetně polyolů
  • Cukry – mono- a disacharidy bez polyolů

To, že je sacharid metabolizován člověkem, znamená, že se jedná o molekulu složenou z molekul glukosy, popřípadě fruktosy vázané α-glykosidickou vazbou. Enzymatický aparát člověka je uzpůsoben právě na štěpení α-glykosidické vazby, za vzniku jednoduchých molekul glukosy, která je zdrojem energie. Nízkomolekulární sacharidy jsou označovány jako cukry a jsou organismem ihned využívány. Proto se někdy označují jako sacharidy a jsou v nutričním označení samostatně vymezeny. Oligosacharidy a polysacharidy jsou energetickým potenciálem pro organismus, ale aby je organismus mohl využít jako energetického zdroje, musí být v trávicím traktu příslušné glykosidické vazby enzymaticky rozštěpeny právě na cukry. Na základě tohoto faktu bylo vydáno Nařízením komise (EU) č. 117/2010 o stanovení obsahu dextrinů (EU, 2010) a Nařízením Komise (EU) č. 900/2008 o analytických metodách a jiných technických ustanoveních nezbytných k provádění režimu vývozu zboží (EU, 2008), které mimo jiné obsahuje povinnost enzymatického štěpení sacharidů s následným stanovením uvolněné glukosy metodou kapalinové chromatografie.

Sacharidy obsažené v pivu pocházejí ze sladu, kde vznikají ve fázi rmutování enzymatickým štěpením. V pivu jsou obsaženy tzv. zkvasitelné cukry jako fruktosa, glukosa a maltosa a sacharid maltotriosa. Ty lze stanovit metodami EBC 8.7, EBC 9.2.7 a MEBAK 2.7.2. (EBC, 2009a; b; MEBAK, 2013a). V poměrně významných koncentracích lze v pivu detekovat také tzv. oligosacharidy (dextriny), což jsou řetězce vzniklé spojením molekul 4 až 10 jednotek glukosy (DP4 – DP10, DP značí zkratku z anglického „degree of polymerization“). Asi jednu třetinu celkové koncentrace sacharidů v pivu tvoří polysacharidy obsahující více jak deset jednotek glukosy. Sumu všech vyjmenovaných sacharidů lze stanovit metodou MEBAK 2.7.3. (MEBAK, 2013b), která je založená na dehydrataci kyselinou sírovou za vzniku 5-hydroxymethylfurfuralu. Ten poskytuje s anthronem barevný produkt stanovovaný kolorimetricky při 625 nm. Tato metoda však nevyhovuje Nařízení komise (EU) č. 117/2010. Podle tohoto nařízení musí být metoda stanovení sacharidů v nápojích a potravinách založena na enzymatické konverzi oligomerů a polymerů sacharidů na glukosu pomocí amylasy nebo amyloglukosidasy, stanovení glukosy musí být provedeno metou HPLC. Jak se ukázalo při vývoji metody (Jurková et al., 2014), účinnost enzymů je negativně ovlivněna přítomností alkoholu. Proto bylo potřeba metodu optimalizovat na maximální možný stupeň konverze. Nerozštěpené oligomery a polymery, zhruba asi 5 % původních sacharidů, jsou pak stanoveny společně s glukosou metodou HPLC s RI (Refractive Index) detekcí.

Stejná instrumentace a HPLC metoda je používaná také pro zjištění původního profilu oligosacharidů do DP10 a glycerolu (polyolu) ve sladině, mladině a pivu, metoda nevyžaduje enzymatické štěpení a vzorek je pouze vhodně naředěn a zfiltrován.

2 METODIKA

2.1 Příprava vzorku - ezymatické štěpení sacharidů

K enzymatickému štěpení oligo- a polysacharidů v pivu se používá amyloglukosidáza z Aspergillus niger (70 units/mg, Sigma Aldrich, Česká republika). Štěpení probíhá ve 100 ml odměrných baňkách vložených do termostatu při teplotě 60 °C po dobu 120 minut. Roztok štěpícího enzymu amyloglukosidasy se přidá k analyzovanému vzorku piva až po vytemperování na požadovanou teplotu 60 °C, od té doby se počítá doba 120 min potřebná k optimálnímu stupni konverze. Po jejím uplynutí je štěpení ukončeno inaktivací enzymu při teplotě 80 °C. Vzorek se odstředí, ochladí na laboratorní teplotu a 10 x zředí ultračistou vodou.

2.2 HPLC stanovení

Pro komplexní analýzu sacharidů piva a sladiny byla použita Rezex RSO - Oligosaccharide kolona s iontovou výměnou v Ag+ cyklu (200×10 mm; Phenomenex, USA). Tato kolona, vyrobená ze sulfonovaného styren-divinylbenzenu se 4 % zesítěním, funguje především jako molekulární síto. Sacharidy a glycerol jsou eluovány v pořadí podle rozměrů molekul, to znamená, že jako poslední jsou eluovány malé molekuly glycerol, fruktosa a glukosa, zatímco oligosacharidy eluují dříve, a to v pořadí sestupném vzhledem ke stupni polymerace (Phenomenex, 2014). Jednotlivé eluující zóny sacharidů jsou pak kvantifi kovány vysoce citlivým refraktometrickým detektorem (Shodex RI – 101).

Mobilní fáze je tvořena pouze ultračistou vodou (Millipore, USA). Její čistota (zejména nízký obsah iontů redukujících kationt Ag+ na neutrální Ag) je důležitá pro dlouhou životnost kolony, neboť vyredukované Ag nenávratně ucpává póry v koloně. Na redukci Ag iontů se podílejí i samotné redukující sacharidy, neboť ve vodné mobilní fázi nastává rovnováha mezi lineární a cyklickou formou, z nichž lineární forma s aldehydickou skupinou je schopna redukovat Ag ionty. Nástřik matrice na kolonu musí být proto omezen na minimum a vzorky jsou před vlastní analýzou většinou ředěny. Kolona je temperována na 85 °C, průtok mobilní fáze je 0,3 ml/min, objem nástřiku je 10 μl. Stanovované analyty jsou glycerol, fruktosa, glukosa, maltosa, oligosacharidy DP3 – DP10.

Pokud analyzovaný vzorek obsahuje sacharózu, v prostředí vodné mobilní fáze a stříbrných iontů kolony při teplotě 85 °C dochází k její úplné degradaci na glukosu a fruktosu. Pro stanovení sacharózy se proto volí separace na NH2 kolonách, kde k tomuto jevu nedochází. Při stanovení sacharidů ve sladině a mladině se původní vzorek musí naředit 50krát, pivo se po odpěnění a odstranění oxidu uhličitého ředí 10krát. K ředění se používá výhradně ultračistá voda s vysokým stupněm deionizace. Zjištěné hodnoty koncentrací zředěných vzorků by se měly nacházet v lineární části kalibrační křivky, jinak je potřeba vzorky více ředit.

Pro přípravu kalibračních roztoků se používají standardy základních cukrů, a to: D(+)-glukosa bezvodá, D(-)-fruktosa a maltosa monohydrát (Merck, Česká republika), a pro stanovení polyolů glycerol (99 %, Sigma-Aldrich, Česká republika). Do 100 ml odměrky se naváží 0,5 g (s přesností 0,1 mg) každého standardu cukru a doplní se po rysku roztokem glycerolu o koncentraci 0,5 g/100 ml. Tento zásobní roztok je dále postupně ředěn deionizovanou vodou tak, aby byly získány kalibrační roztoky v rozsahu koncentrací 0,001 až 0,1 g/100 ml. Maltosa a vyšší oligosacharidy jsou vyhodnocovány podle bezvodé maltosy. Koncentrace pro maltosu jsou proto v kalibraci násobeny koeficientem 0,950002.

Na obr. 1 a 2 je uveden příklad analýzy sacharidů v reálném vzorku nealkoholického piva před a po enzymatickém štěpení. Z jejich porovnání je zřejmý nárůst koncentrace glukosy způsobený více jak 95 % konverzí sacharidů. Jelikož je enzymatické štěpení proces dynamický, v okamžiku jeho přerušení v roztoku zůstávají zbytkové DP oligomery, a i když představují minoritní část, musí být zahrnuty do výpočtu celkového obsahu sacharidů. Při výpočtu celkové koncentrace sacharidů je dále provedena korekce na změnu objemu vzorku přidáním roztoku enzymu (dle použitých objemů) a korekce na účinnost enzymu v závislosti na obsahu alkoholu (tab. 1).

Obr. 1 Chromatogram reálného vzorku nealkoholického piva před enzymatickým štěpením

Obr. 2 Chromatogram reálného vzorku nealkoholického piva po enzymatickém štěpení

Tab. 1 Koeficient výtěžnosti v závislosti na obsahu alkoholu (% obj.)

Účinnost enzymu amyloglukosidasy je pravidelně ověřována pomocí přídavku známé koncentrace maltodextrinu (4 g/100 ml) do nealkoholického piva. Enzymaticky jsou štěpeny původní nealkoholické pivo a nealkoholické pivo s přídavkem maltodextrinu a u obou je změřen celkový obsah sacharidů po štěpení. Rozdíl obou hodnot vyjádřený v procentech vzhledem k hodnotě přídavku maltodextrinu (100 %) vyjadřuje účinnost štěpení.

2.3 Kvantifikace oligomerů DP3 až DP10

Vzhledem ke špatné dostupnosti a vysoké ceně standardů oligomerů, jsou koncentrace oligomerů DP3-DP10 vyhodnoceny pomocí standardu maltosy a získané hodnoty koncentrací jsou pak násobeny relativními odezvovými faktory vzhledem k maltose pro jednotlivé oligomery, získané samostatným měřením pro všechny oligomery včetně maltosy metodou standardního přídavku. Pro DP3 byl získán faktor 1,1; pro DP4 1,3. Vzhledem k nízké koncentraci oligomerů DP5 – DP10 a jejich rozpětí odezvových faktorů v úzkém rozmezí 1,4–1,6 byla hodnota faktoru pro tyto analyty aproximována na hodnotu 1,5.

2.4 Výpočty

Pro výpočet koncentrací jednotlivých sacharidů v pivu, sladině nebo mladině, tj. bez enzymatického štěpení, použijeme následující rovnici

c(p, s, m) = cx . d

kde c(p, s, m) je koncentrace jednotlivého sacharidu v pivu, sladině nebo mladině, cx je změřená koncentrace jednotlivého sacharidu a d je příslušné ředění.

Celkový obsah monosacharidů a oligosacharidů DP2 až DP10 v pivu, sladině nebo mladině bez štěpení, je potom součtem zjištěných koncentrací

c(p, s, m) = Σcxi . d

kde c(p, s, m) je koncentrace všech sacharidů v pivu, sladině nebo mladině, cx je změřená koncentrace každého sacharidu a d je příslušné ředění.

Laboratorní postup enzymatického štěpení sacharidů v pivu pro zjištění celkové koncentrace sacharidů, tj. i těch v pivu přítomných ve formě polysacharidů a glycerolu, v sobě zahrnuje kroky, které jsou zohledněny ve výpočtu odpovídajícími korekčními faktory:

cp = Σcxi . d . e / f

kde cp je celkový obsah sacharidů v pivu včetně glycerolu, cxi je změřená koncentrace jednotlivých sacharidů a glycerolu, d je příslušné ředění, e je korekční faktor změny objemu po přídavku roztoku enzymu a f je korekční faktor účinnosti enzymu, jehož hodnota závisí na obs ahu alkoholu v objemových procentech (viz tab. 1).

2.5 Validační parametry

Validační parametry metody, opakovatelnost (r95), limit kvantifikace přístroje (ILOQ), limit kvantifikace metody (MLOQ) a variační koeficient při koncentraci MLOQ a deseti opakováních (CV) je pro jednotlivé sacharidy uveden v tab. 2.

Tab. 2 Validační parametry metody

3 OVĚŘENÍ METODY

Pro ověření správnosti metody bylo použito srovnání celkové koncentrace sacharidů s reálným extraktem piva, který je tvořen právě sacharidy, dále bílkovinami, organickými kyselinami, minerálními látkami a dalšími minoritními sloučeninami (podrobné informace o nutričním složení piva budou zveřejněny v následném článku Olšovská et al: Energetická hodnota piva, který vyjde srpnu 2018).

V tab. 3 je uveden přehled srovnávaných vzorků, 10 nealkoholických (vzorky 1–10) a 10 alkoholických (vzorky 11–20) piv.

Tabulka 3 Srovnání výsledků celkových sacharidů a skutečného extraktu

V nealkoholických pivech byl nalezen obsah celkových sacharidů od 3,07 do 7,53 g/100 ml s odpovídajícím rozpětím extraktu od 3,17 do 7,94 %. To odpovídá 90,5 až 97,9 % skutečného extraktu s průměrnou hodnotou 94,3 %. Obsah celkových sacharidů v alkoholických pivech se pohyboval v rozmezí 3,19 až 4,35 g/100 ml s odpovídajícím extraktem 3,44 až 5,02 %. Sacharidy v těchto alkoholických pivech tedy představují 86,5 až 92,7 %. Vyšší procento sacharidů v extraktu v nealkoholických pivech je způsobeno nižším stupněm prokvašení, procentní obsah ostatních sloučenin je pak nižší než u běžného alkoholického piva. Vzhledem k těmto výsledkům lze konstatovat, že metoda poskytuje správné výsledky (Jurková et al., 2014).

4 APLIKACE METODY, MONITORING CUKRŮ A SACHARIDŮ V ČESKÝCH PIVECH

VÚPS metodiku stanovení cukrů a sacharidů pro nutriční značení piva provádí již od roku 2012, v roce 2013 byla akreditována Českým institutem pro akreditaci podle normy ISO EN 17025, v roce 2014 byla metodika publikována v zahraničním recenzovaném časopise Food Analytical Methods (Jurková et al., 2014) a certifikována Úřadem pro potraviny na Ministerstvu zemědělství ČR. Řada českých pivovarů již rutinně využívá metodu stanovení sacharidů a cukrů pro značení těchto hodnot na etiketách. Získaná data za období 2016 a 2017 byla statisticky zpracována a vyhodnocena.

4.1 Stanovení profilu oligosacharidů ve sladině

Na obr. 3 je profi l sacharidů do DP10, kterou lze provést popsanou HPLC metodou bez předchozího enzymatického štěpení. Tato metoda je vhodná pro určení sacharidického složení sladiny nebo mladiny, zejména z důvodu obsahu zkvasitelných cukrů. Po integraci chromatografických píků uvedeného příkladu získáme hodnoty cukrů a oligosacharidů uvedených v tab. 4. Výsledná koncentrace sacharidů 8,58 g/100 ml udává koncentraci do DP 10.

Obr. 3 Separace dextrinů DP10 ve sladině (bez enzymatického štěpení)

Tab. 4 Hodno ty sacharidů v modelových vzorcích

4.2 Stanovení celkových sacharidů a z toho cukrů v pivu

Pro potřeby stanovení celkových sacharidů a z toho cukrů, zejména pro nutriční značení piva, se používá následující postup. Nejdříve se změří obsah cukrů v pivu bez štěpení, originální pivo se pouze naředí a stanoví se obsah glukosy, fruktosy a maltosy a tyto tři hodnoty se sečtou. Zároveň je stanoven glycerol. Takto získáme hodnotu cukrů. Příklad analýzy je uveden na obr. 1 a příslušné hodnoty jsou uvedeny v tab. 4. V druhém kroku je pivo enzymaticky štěpeno a zhruba 95 % všech sacharidů je převedeno na glukosu. Pomocí HPLC stanovení je zjištěn obsah vzniklé glukosy a připočten obsah zbytkových nerozštěpených sacharidů, čímž získáme hodnotu celkových sacharidů. Příklad HPLC analýzy celkových sacharidů je uveden na obr. 2 a příslušné hodnoty jsou uvedeny v tab. 4.

Z tab. 4 je zřejmé, jak velká část sacharidů s vyšším polymeračním stupněm nad DP10 je v pivu obsažena. Pokud sečteme separované sacharidy v pivu, které nebyl o štěpeno, získáme v našem konkrétním příkladu hodnotu 3,35 g/100 ml. Pokud provedeme enzymatické štěpení, celková hodnota sacharidů je 4,55. Rozdíl mezi těmito hodnotami, tedy 1,20 g/100 ml, je koncentrace sacharidů nad DP10, které, jak je vidět, nelze z nutričního hlediska zanedbat, neboť tvoří 26 % celkové koncentrace sacharidů. Tento rozdíl je platný pro všechna piva, lze konstatovat, že zhruba 30 % tvoří v pivu sacharidy s vyšším stupněm polymerace než DP10.

5 ZÁVĚR

Metodu stanovení sacharidů pomocí HPLC s RI detekcí na chromatografické koloně s iontovou výměnou v Ag+ cyklu lze využít pro stanovení cukrů i sacharidů v pivu, sladině i mladině s následujícími možnostmi využití. První aplikace, která poskytuje informaci o účinnosti rmutování, je stanovení profilu zkvasitelných cukrů a oligosacharidů ve sladině a mladině. V tomto případě je vzorek pouze vhodně naředěn a ihned chromatograficky analyzován. Pokud chceme znát koncentraci cukrů a glycerolu v pivu pro nutriční značení piva, použijeme metodu stejným způsobem. Konečně pro zjištění celkové koncentrace sacharidů v pivu pro nutriční značení provedeme enzymatické štěpení na glukosu a tu pak stanovíme metodou HPLC-RI. Metoda je dobře opakovatelná, má dobrou výtěžnost a v rámci mezilaboratorních testů poskytuje výborné výsledky.

Kvasný průmysl
 

Mohlo by Vás zajímat

Metabolome Analysis of Hydrophilic Metabolites in Saliva Using LCMS™-8060NX Triple Quadrupole Mass Spectrometer

Aplikace
| 2017 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Metabolomika

A Predictive Compound Database Approach to the Tentative Identification and Semiquantitation of Volatile-Phenol Glycosides in Smoke‑Affected Grapes from Wildfires

Aplikace
| 2019 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Discovery of the Potential Marker Compounds for Stored White Tea by a Metabolomics Approach

Aplikace
| 2019 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Potraviny a zemědělství, Metabolomika
 

Podobné články

Stanovení cukrů a celkových sacharidů v pivu
St, 18.11.2020
| Originální článek z: Kvasný Průmysl
Metodu stanovení sacharidů pomocí HPLC s RI detekcí na chromatografické koloně s iontovou výměnou v Ag+ cyklu lze využít pro stanovení cukrů i sacharidů v pivu, sladině i mladině.

Pixabay/nastogadka: Stanovení cukrů a celkových sacharidů v pivu

1 ÚVOD

Současná legislativa, Nařízení Evropského parlamentu a požadavky Rady No. 1169/2011 (EU, 2011), ukládá výrobcům potravinářských komodit povinnost informovat spotřebitele o energetickém obsahu jednotlivých druhů potravin a nápojů. Další povinností vyplývající z tohoto nařízení je označovat tzv. nutriční složení potraviny a řady nápojů, jako např. nealkoholického piva. Jedním z významných nutričních parametrů je informace o koncentraci celkových sacharidů a z toho cukrů. Podle definice uvedené v nařízení je:

  • Sacharidy – každý sacharid metabolizovaný člověkem, včetně polyolů
  • Cukry – mono- a disacharidy bez polyolů

To, že je sacharid metabolizován člověkem, znamená, že se jedná o molekulu složenou z molekul glukosy, popřípadě fruktosy vázané α-glykosidickou vazbou. Enzymatický aparát člověka je uzpůsoben právě na štěpení α-glykosidické vazby, za vzniku jednoduchých molekul glukosy, která je zdrojem energie. Nízkomolekulární sacharidy jsou označovány jako cukry a jsou organismem ihned využívány. Proto se někdy označují jako sacharidy a jsou v nutričním označení samostatně vymezeny. Oligosacharidy a polysacharidy jsou energetickým potenciálem pro organismus, ale aby je organismus mohl využít jako energetického zdroje, musí být v trávicím traktu příslušné glykosidické vazby enzymaticky rozštěpeny právě na cukry. Na základě tohoto faktu bylo vydáno Nařízením komise (EU) č. 117/2010 o stanovení obsahu dextrinů (EU, 2010) a Nařízením Komise (EU) č. 900/2008 o analytických metodách a jiných technických ustanoveních nezbytných k provádění režimu vývozu zboží (EU, 2008), které mimo jiné obsahuje povinnost enzymatického štěpení sacharidů s následným stanovením uvolněné glukosy metodou kapalinové chromatografie.

Sacharidy obsažené v pivu pocházejí ze sladu, kde vznikají ve fázi rmutování enzymatickým štěpením. V pivu jsou obsaženy tzv. zkvasitelné cukry jako fruktosa, glukosa a maltosa a sacharid maltotriosa. Ty lze stanovit metodami EBC 8.7, EBC 9.2.7 a MEBAK 2.7.2. (EBC, 2009a; b; MEBAK, 2013a). V poměrně významných koncentracích lze v pivu detekovat také tzv. oligosacharidy (dextriny), což jsou řetězce vzniklé spojením molekul 4 až 10 jednotek glukosy (DP4 – DP10, DP značí zkratku z anglického „degree of polymerization“). Asi jednu třetinu celkové koncentrace sacharidů v pivu tvoří polysacharidy obsahující více jak deset jednotek glukosy. Sumu všech vyjmenovaných sacharidů lze stanovit metodou MEBAK 2.7.3. (MEBAK, 2013b), která je založená na dehydrataci kyselinou sírovou za vzniku 5-hydroxymethylfurfuralu. Ten poskytuje s anthronem barevný produkt stanovovaný kolorimetricky při 625 nm. Tato metoda však nevyhovuje Nařízení komise (EU) č. 117/2010. Podle tohoto nařízení musí být metoda stanovení sacharidů v nápojích a potravinách založena na enzymatické konverzi oligomerů a polymerů sacharidů na glukosu pomocí amylasy nebo amyloglukosidasy, stanovení glukosy musí být provedeno metou HPLC. Jak se ukázalo při vývoji metody (Jurková et al., 2014), účinnost enzymů je negativně ovlivněna přítomností alkoholu. Proto bylo potřeba metodu optimalizovat na maximální možný stupeň konverze. Nerozštěpené oligomery a polymery, zhruba asi 5 % původních sacharidů, jsou pak stanoveny společně s glukosou metodou HPLC s RI (Refractive Index) detekcí.

Stejná instrumentace a HPLC metoda je používaná také pro zjištění původního profilu oligosacharidů do DP10 a glycerolu (polyolu) ve sladině, mladině a pivu, metoda nevyžaduje enzymatické štěpení a vzorek je pouze vhodně naředěn a zfiltrován.

2 METODIKA

2.1 Příprava vzorku - ezymatické štěpení sacharidů

K enzymatickému štěpení oligo- a polysacharidů v pivu se používá amyloglukosidáza z Aspergillus niger (70 units/mg, Sigma Aldrich, Česká republika). Štěpení probíhá ve 100 ml odměrných baňkách vložených do termostatu při teplotě 60 °C po dobu 120 minut. Roztok štěpícího enzymu amyloglukosidasy se přidá k analyzovanému vzorku piva až po vytemperování na požadovanou teplotu 60 °C, od té doby se počítá doba 120 min potřebná k optimálnímu stupni konverze. Po jejím uplynutí je štěpení ukončeno inaktivací enzymu při teplotě 80 °C. Vzorek se odstředí, ochladí na laboratorní teplotu a 10 x zředí ultračistou vodou.

2.2 HPLC stanovení

Pro komplexní analýzu sacharidů piva a sladiny byla použita Rezex RSO - Oligosaccharide kolona s iontovou výměnou v Ag+ cyklu (200×10 mm; Phenomenex, USA). Tato kolona, vyrobená ze sulfonovaného styren-divinylbenzenu se 4 % zesítěním, funguje především jako molekulární síto. Sacharidy a glycerol jsou eluovány v pořadí podle rozměrů molekul, to znamená, že jako poslední jsou eluovány malé molekuly glycerol, fruktosa a glukosa, zatímco oligosacharidy eluují dříve, a to v pořadí sestupném vzhledem ke stupni polymerace (Phenomenex, 2014). Jednotlivé eluující zóny sacharidů jsou pak kvantifi kovány vysoce citlivým refraktometrickým detektorem (Shodex RI – 101).

Mobilní fáze je tvořena pouze ultračistou vodou (Millipore, USA). Její čistota (zejména nízký obsah iontů redukujících kationt Ag+ na neutrální Ag) je důležitá pro dlouhou životnost kolony, neboť vyredukované Ag nenávratně ucpává póry v koloně. Na redukci Ag iontů se podílejí i samotné redukující sacharidy, neboť ve vodné mobilní fázi nastává rovnováha mezi lineární a cyklickou formou, z nichž lineární forma s aldehydickou skupinou je schopna redukovat Ag ionty. Nástřik matrice na kolonu musí být proto omezen na minimum a vzorky jsou před vlastní analýzou většinou ředěny. Kolona je temperována na 85 °C, průtok mobilní fáze je 0,3 ml/min, objem nástřiku je 10 μl. Stanovované analyty jsou glycerol, fruktosa, glukosa, maltosa, oligosacharidy DP3 – DP10.

Pokud analyzovaný vzorek obsahuje sacharózu, v prostředí vodné mobilní fáze a stříbrných iontů kolony při teplotě 85 °C dochází k její úplné degradaci na glukosu a fruktosu. Pro stanovení sacharózy se proto volí separace na NH2 kolonách, kde k tomuto jevu nedochází. Při stanovení sacharidů ve sladině a mladině se původní vzorek musí naředit 50krát, pivo se po odpěnění a odstranění oxidu uhličitého ředí 10krát. K ředění se používá výhradně ultračistá voda s vysokým stupněm deionizace. Zjištěné hodnoty koncentrací zředěných vzorků by se měly nacházet v lineární části kalibrační křivky, jinak je potřeba vzorky více ředit.

Pro přípravu kalibračních roztoků se používají standardy základních cukrů, a to: D(+)-glukosa bezvodá, D(-)-fruktosa a maltosa monohydrát (Merck, Česká republika), a pro stanovení polyolů glycerol (99 %, Sigma-Aldrich, Česká republika). Do 100 ml odměrky se naváží 0,5 g (s přesností 0,1 mg) každého standardu cukru a doplní se po rysku roztokem glycerolu o koncentraci 0,5 g/100 ml. Tento zásobní roztok je dále postupně ředěn deionizovanou vodou tak, aby byly získány kalibrační roztoky v rozsahu koncentrací 0,001 až 0,1 g/100 ml. Maltosa a vyšší oligosacharidy jsou vyhodnocovány podle bezvodé maltosy. Koncentrace pro maltosu jsou proto v kalibraci násobeny koeficientem 0,950002.

Na obr. 1 a 2 je uveden příklad analýzy sacharidů v reálném vzorku nealkoholického piva před a po enzymatickém štěpení. Z jejich porovnání je zřejmý nárůst koncentrace glukosy způsobený více jak 95 % konverzí sacharidů. Jelikož je enzymatické štěpení proces dynamický, v okamžiku jeho přerušení v roztoku zůstávají zbytkové DP oligomery, a i když představují minoritní část, musí být zahrnuty do výpočtu celkového obsahu sacharidů. Při výpočtu celkové koncentrace sacharidů je dále provedena korekce na změnu objemu vzorku přidáním roztoku enzymu (dle použitých objemů) a korekce na účinnost enzymu v závislosti na obsahu alkoholu (tab. 1).

Obr. 1 Chromatogram reálného vzorku nealkoholického piva před enzymatickým štěpením

Obr. 2 Chromatogram reálného vzorku nealkoholického piva po enzymatickém štěpení

Tab. 1 Koeficient výtěžnosti v závislosti na obsahu alkoholu (% obj.)

Účinnost enzymu amyloglukosidasy je pravidelně ověřována pomocí přídavku známé koncentrace maltodextrinu (4 g/100 ml) do nealkoholického piva. Enzymaticky jsou štěpeny původní nealkoholické pivo a nealkoholické pivo s přídavkem maltodextrinu a u obou je změřen celkový obsah sacharidů po štěpení. Rozdíl obou hodnot vyjádřený v procentech vzhledem k hodnotě přídavku maltodextrinu (100 %) vyjadřuje účinnost štěpení.

2.3 Kvantifikace oligomerů DP3 až DP10

Vzhledem ke špatné dostupnosti a vysoké ceně standardů oligomerů, jsou koncentrace oligomerů DP3-DP10 vyhodnoceny pomocí standardu maltosy a získané hodnoty koncentrací jsou pak násobeny relativními odezvovými faktory vzhledem k maltose pro jednotlivé oligomery, získané samostatným měřením pro všechny oligomery včetně maltosy metodou standardního přídavku. Pro DP3 byl získán faktor 1,1; pro DP4 1,3. Vzhledem k nízké koncentraci oligomerů DP5 – DP10 a jejich rozpětí odezvových faktorů v úzkém rozmezí 1,4–1,6 byla hodnota faktoru pro tyto analyty aproximována na hodnotu 1,5.

2.4 Výpočty

Pro výpočet koncentrací jednotlivých sacharidů v pivu, sladině nebo mladině, tj. bez enzymatického štěpení, použijeme následující rovnici

c(p, s, m) = cx . d

kde c(p, s, m) je koncentrace jednotlivého sacharidu v pivu, sladině nebo mladině, cx je změřená koncentrace jednotlivého sacharidu a d je příslušné ředění.

Celkový obsah monosacharidů a oligosacharidů DP2 až DP10 v pivu, sladině nebo mladině bez štěpení, je potom součtem zjištěných koncentrací

c(p, s, m) = Σcxi . d

kde c(p, s, m) je koncentrace všech sacharidů v pivu, sladině nebo mladině, cx je změřená koncentrace každého sacharidu a d je příslušné ředění.

Laboratorní postup enzymatického štěpení sacharidů v pivu pro zjištění celkové koncentrace sacharidů, tj. i těch v pivu přítomných ve formě polysacharidů a glycerolu, v sobě zahrnuje kroky, které jsou zohledněny ve výpočtu odpovídajícími korekčními faktory:

cp = Σcxi . d . e / f

kde cp je celkový obsah sacharidů v pivu včetně glycerolu, cxi je změřená koncentrace jednotlivých sacharidů a glycerolu, d je příslušné ředění, e je korekční faktor změny objemu po přídavku roztoku enzymu a f je korekční faktor účinnosti enzymu, jehož hodnota závisí na obs ahu alkoholu v objemových procentech (viz tab. 1).

2.5 Validační parametry

Validační parametry metody, opakovatelnost (r95), limit kvantifikace přístroje (ILOQ), limit kvantifikace metody (MLOQ) a variační koeficient při koncentraci MLOQ a deseti opakováních (CV) je pro jednotlivé sacharidy uveden v tab. 2.

Tab. 2 Validační parametry metody

3 OVĚŘENÍ METODY

Pro ověření správnosti metody bylo použito srovnání celkové koncentrace sacharidů s reálným extraktem piva, který je tvořen právě sacharidy, dále bílkovinami, organickými kyselinami, minerálními látkami a dalšími minoritními sloučeninami (podrobné informace o nutričním složení piva budou zveřejněny v následném článku Olšovská et al: Energetická hodnota piva, který vyjde srpnu 2018).

V tab. 3 je uveden přehled srovnávaných vzorků, 10 nealkoholických (vzorky 1–10) a 10 alkoholických (vzorky 11–20) piv.

Tabulka 3 Srovnání výsledků celkových sacharidů a skutečného extraktu

V nealkoholických pivech byl nalezen obsah celkových sacharidů od 3,07 do 7,53 g/100 ml s odpovídajícím rozpětím extraktu od 3,17 do 7,94 %. To odpovídá 90,5 až 97,9 % skutečného extraktu s průměrnou hodnotou 94,3 %. Obsah celkových sacharidů v alkoholických pivech se pohyboval v rozmezí 3,19 až 4,35 g/100 ml s odpovídajícím extraktem 3,44 až 5,02 %. Sacharidy v těchto alkoholických pivech tedy představují 86,5 až 92,7 %. Vyšší procento sacharidů v extraktu v nealkoholických pivech je způsobeno nižším stupněm prokvašení, procentní obsah ostatních sloučenin je pak nižší než u běžného alkoholického piva. Vzhledem k těmto výsledkům lze konstatovat, že metoda poskytuje správné výsledky (Jurková et al., 2014).

4 APLIKACE METODY, MONITORING CUKRŮ A SACHARIDŮ V ČESKÝCH PIVECH

VÚPS metodiku stanovení cukrů a sacharidů pro nutriční značení piva provádí již od roku 2012, v roce 2013 byla akreditována Českým institutem pro akreditaci podle normy ISO EN 17025, v roce 2014 byla metodika publikována v zahraničním recenzovaném časopise Food Analytical Methods (Jurková et al., 2014) a certifikována Úřadem pro potraviny na Ministerstvu zemědělství ČR. Řada českých pivovarů již rutinně využívá metodu stanovení sacharidů a cukrů pro značení těchto hodnot na etiketách. Získaná data za období 2016 a 2017 byla statisticky zpracována a vyhodnocena.

4.1 Stanovení profilu oligosacharidů ve sladině

Na obr. 3 je profi l sacharidů do DP10, kterou lze provést popsanou HPLC metodou bez předchozího enzymatického štěpení. Tato metoda je vhodná pro určení sacharidického složení sladiny nebo mladiny, zejména z důvodu obsahu zkvasitelných cukrů. Po integraci chromatografických píků uvedeného příkladu získáme hodnoty cukrů a oligosacharidů uvedených v tab. 4. Výsledná koncentrace sacharidů 8,58 g/100 ml udává koncentraci do DP 10.

Obr. 3 Separace dextrinů DP10 ve sladině (bez enzymatického štěpení)

Tab. 4 Hodno ty sacharidů v modelových vzorcích

4.2 Stanovení celkových sacharidů a z toho cukrů v pivu

Pro potřeby stanovení celkových sacharidů a z toho cukrů, zejména pro nutriční značení piva, se používá následující postup. Nejdříve se změří obsah cukrů v pivu bez štěpení, originální pivo se pouze naředí a stanoví se obsah glukosy, fruktosy a maltosy a tyto tři hodnoty se sečtou. Zároveň je stanoven glycerol. Takto získáme hodnotu cukrů. Příklad analýzy je uveden na obr. 1 a příslušné hodnoty jsou uvedeny v tab. 4. V druhém kroku je pivo enzymaticky štěpeno a zhruba 95 % všech sacharidů je převedeno na glukosu. Pomocí HPLC stanovení je zjištěn obsah vzniklé glukosy a připočten obsah zbytkových nerozštěpených sacharidů, čímž získáme hodnotu celkových sacharidů. Příklad HPLC analýzy celkových sacharidů je uveden na obr. 2 a příslušné hodnoty jsou uvedeny v tab. 4.

Z tab. 4 je zřejmé, jak velká část sacharidů s vyšším polymeračním stupněm nad DP10 je v pivu obsažena. Pokud sečteme separované sacharidy v pivu, které nebyl o štěpeno, získáme v našem konkrétním příkladu hodnotu 3,35 g/100 ml. Pokud provedeme enzymatické štěpení, celková hodnota sacharidů je 4,55. Rozdíl mezi těmito hodnotami, tedy 1,20 g/100 ml, je koncentrace sacharidů nad DP10, které, jak je vidět, nelze z nutričního hlediska zanedbat, neboť tvoří 26 % celkové koncentrace sacharidů. Tento rozdíl je platný pro všechna piva, lze konstatovat, že zhruba 30 % tvoří v pivu sacharidy s vyšším stupněm polymerace než DP10.

5 ZÁVĚR

Metodu stanovení sacharidů pomocí HPLC s RI detekcí na chromatografické koloně s iontovou výměnou v Ag+ cyklu lze využít pro stanovení cukrů i sacharidů v pivu, sladině i mladině s následujícími možnostmi využití. První aplikace, která poskytuje informaci o účinnosti rmutování, je stanovení profilu zkvasitelných cukrů a oligosacharidů ve sladině a mladině. V tomto případě je vzorek pouze vhodně naředěn a ihned chromatograficky analyzován. Pokud chceme znát koncentraci cukrů a glycerolu v pivu pro nutriční značení piva, použijeme metodu stejným způsobem. Konečně pro zjištění celkové koncentrace sacharidů v pivu pro nutriční značení provedeme enzymatické štěpení na glukosu a tu pak stanovíme metodou HPLC-RI. Metoda je dobře opakovatelná, má dobrou výtěžnost a v rámci mezilaboratorních testů poskytuje výborné výsledky.

Kvasný průmysl
 

Mohlo by Vás zajímat

Metabolome Analysis of Hydrophilic Metabolites in Saliva Using LCMS™-8060NX Triple Quadrupole Mass Spectrometer

Aplikace
| 2017 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Metabolomika

A Predictive Compound Database Approach to the Tentative Identification and Semiquantitation of Volatile-Phenol Glycosides in Smoke‑Affected Grapes from Wildfires

Aplikace
| 2019 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Discovery of the Potential Marker Compounds for Stored White Tea by a Metabolomics Approach

Aplikace
| 2019 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Potraviny a zemědělství, Metabolomika
 

Podobné články

Stanovení cukrů a celkových sacharidů v pivu
St, 18.11.2020
| Originální článek z: Kvasný Průmysl
Metodu stanovení sacharidů pomocí HPLC s RI detekcí na chromatografické koloně s iontovou výměnou v Ag+ cyklu lze využít pro stanovení cukrů i sacharidů v pivu, sladině i mladině.

Pixabay/nastogadka: Stanovení cukrů a celkových sacharidů v pivu

1 ÚVOD

Současná legislativa, Nařízení Evropského parlamentu a požadavky Rady No. 1169/2011 (EU, 2011), ukládá výrobcům potravinářských komodit povinnost informovat spotřebitele o energetickém obsahu jednotlivých druhů potravin a nápojů. Další povinností vyplývající z tohoto nařízení je označovat tzv. nutriční složení potraviny a řady nápojů, jako např. nealkoholického piva. Jedním z významných nutričních parametrů je informace o koncentraci celkových sacharidů a z toho cukrů. Podle definice uvedené v nařízení je:

  • Sacharidy – každý sacharid metabolizovaný člověkem, včetně polyolů
  • Cukry – mono- a disacharidy bez polyolů

To, že je sacharid metabolizován člověkem, znamená, že se jedná o molekulu složenou z molekul glukosy, popřípadě fruktosy vázané α-glykosidickou vazbou. Enzymatický aparát člověka je uzpůsoben právě na štěpení α-glykosidické vazby, za vzniku jednoduchých molekul glukosy, která je zdrojem energie. Nízkomolekulární sacharidy jsou označovány jako cukry a jsou organismem ihned využívány. Proto se někdy označují jako sacharidy a jsou v nutričním označení samostatně vymezeny. Oligosacharidy a polysacharidy jsou energetickým potenciálem pro organismus, ale aby je organismus mohl využít jako energetického zdroje, musí být v trávicím traktu příslušné glykosidické vazby enzymaticky rozštěpeny právě na cukry. Na základě tohoto faktu bylo vydáno Nařízením komise (EU) č. 117/2010 o stanovení obsahu dextrinů (EU, 2010) a Nařízením Komise (EU) č. 900/2008 o analytických metodách a jiných technických ustanoveních nezbytných k provádění režimu vývozu zboží (EU, 2008), které mimo jiné obsahuje povinnost enzymatického štěpení sacharidů s následným stanovením uvolněné glukosy metodou kapalinové chromatografie.

Sacharidy obsažené v pivu pocházejí ze sladu, kde vznikají ve fázi rmutování enzymatickým štěpením. V pivu jsou obsaženy tzv. zkvasitelné cukry jako fruktosa, glukosa a maltosa a sacharid maltotriosa. Ty lze stanovit metodami EBC 8.7, EBC 9.2.7 a MEBAK 2.7.2. (EBC, 2009a; b; MEBAK, 2013a). V poměrně významných koncentracích lze v pivu detekovat také tzv. oligosacharidy (dextriny), což jsou řetězce vzniklé spojením molekul 4 až 10 jednotek glukosy (DP4 – DP10, DP značí zkratku z anglického „degree of polymerization“). Asi jednu třetinu celkové koncentrace sacharidů v pivu tvoří polysacharidy obsahující více jak deset jednotek glukosy. Sumu všech vyjmenovaných sacharidů lze stanovit metodou MEBAK 2.7.3. (MEBAK, 2013b), která je založená na dehydrataci kyselinou sírovou za vzniku 5-hydroxymethylfurfuralu. Ten poskytuje s anthronem barevný produkt stanovovaný kolorimetricky při 625 nm. Tato metoda však nevyhovuje Nařízení komise (EU) č. 117/2010. Podle tohoto nařízení musí být metoda stanovení sacharidů v nápojích a potravinách založena na enzymatické konverzi oligomerů a polymerů sacharidů na glukosu pomocí amylasy nebo amyloglukosidasy, stanovení glukosy musí být provedeno metou HPLC. Jak se ukázalo při vývoji metody (Jurková et al., 2014), účinnost enzymů je negativně ovlivněna přítomností alkoholu. Proto bylo potřeba metodu optimalizovat na maximální možný stupeň konverze. Nerozštěpené oligomery a polymery, zhruba asi 5 % původních sacharidů, jsou pak stanoveny společně s glukosou metodou HPLC s RI (Refractive Index) detekcí.

Stejná instrumentace a HPLC metoda je používaná také pro zjištění původního profilu oligosacharidů do DP10 a glycerolu (polyolu) ve sladině, mladině a pivu, metoda nevyžaduje enzymatické štěpení a vzorek je pouze vhodně naředěn a zfiltrován.

2 METODIKA

2.1 Příprava vzorku - ezymatické štěpení sacharidů

K enzymatickému štěpení oligo- a polysacharidů v pivu se používá amyloglukosidáza z Aspergillus niger (70 units/mg, Sigma Aldrich, Česká republika). Štěpení probíhá ve 100 ml odměrných baňkách vložených do termostatu při teplotě 60 °C po dobu 120 minut. Roztok štěpícího enzymu amyloglukosidasy se přidá k analyzovanému vzorku piva až po vytemperování na požadovanou teplotu 60 °C, od té doby se počítá doba 120 min potřebná k optimálnímu stupni konverze. Po jejím uplynutí je štěpení ukončeno inaktivací enzymu při teplotě 80 °C. Vzorek se odstředí, ochladí na laboratorní teplotu a 10 x zředí ultračistou vodou.

2.2 HPLC stanovení

Pro komplexní analýzu sacharidů piva a sladiny byla použita Rezex RSO - Oligosaccharide kolona s iontovou výměnou v Ag+ cyklu (200×10 mm; Phenomenex, USA). Tato kolona, vyrobená ze sulfonovaného styren-divinylbenzenu se 4 % zesítěním, funguje především jako molekulární síto. Sacharidy a glycerol jsou eluovány v pořadí podle rozměrů molekul, to znamená, že jako poslední jsou eluovány malé molekuly glycerol, fruktosa a glukosa, zatímco oligosacharidy eluují dříve, a to v pořadí sestupném vzhledem ke stupni polymerace (Phenomenex, 2014). Jednotlivé eluující zóny sacharidů jsou pak kvantifi kovány vysoce citlivým refraktometrickým detektorem (Shodex RI – 101).

Mobilní fáze je tvořena pouze ultračistou vodou (Millipore, USA). Její čistota (zejména nízký obsah iontů redukujících kationt Ag+ na neutrální Ag) je důležitá pro dlouhou životnost kolony, neboť vyredukované Ag nenávratně ucpává póry v koloně. Na redukci Ag iontů se podílejí i samotné redukující sacharidy, neboť ve vodné mobilní fázi nastává rovnováha mezi lineární a cyklickou formou, z nichž lineární forma s aldehydickou skupinou je schopna redukovat Ag ionty. Nástřik matrice na kolonu musí být proto omezen na minimum a vzorky jsou před vlastní analýzou většinou ředěny. Kolona je temperována na 85 °C, průtok mobilní fáze je 0,3 ml/min, objem nástřiku je 10 μl. Stanovované analyty jsou glycerol, fruktosa, glukosa, maltosa, oligosacharidy DP3 – DP10.

Pokud analyzovaný vzorek obsahuje sacharózu, v prostředí vodné mobilní fáze a stříbrných iontů kolony při teplotě 85 °C dochází k její úplné degradaci na glukosu a fruktosu. Pro stanovení sacharózy se proto volí separace na NH2 kolonách, kde k tomuto jevu nedochází. Při stanovení sacharidů ve sladině a mladině se původní vzorek musí naředit 50krát, pivo se po odpěnění a odstranění oxidu uhličitého ředí 10krát. K ředění se používá výhradně ultračistá voda s vysokým stupněm deionizace. Zjištěné hodnoty koncentrací zředěných vzorků by se měly nacházet v lineární části kalibrační křivky, jinak je potřeba vzorky více ředit.

Pro přípravu kalibračních roztoků se používají standardy základních cukrů, a to: D(+)-glukosa bezvodá, D(-)-fruktosa a maltosa monohydrát (Merck, Česká republika), a pro stanovení polyolů glycerol (99 %, Sigma-Aldrich, Česká republika). Do 100 ml odměrky se naváží 0,5 g (s přesností 0,1 mg) každého standardu cukru a doplní se po rysku roztokem glycerolu o koncentraci 0,5 g/100 ml. Tento zásobní roztok je dále postupně ředěn deionizovanou vodou tak, aby byly získány kalibrační roztoky v rozsahu koncentrací 0,001 až 0,1 g/100 ml. Maltosa a vyšší oligosacharidy jsou vyhodnocovány podle bezvodé maltosy. Koncentrace pro maltosu jsou proto v kalibraci násobeny koeficientem 0,950002.

Na obr. 1 a 2 je uveden příklad analýzy sacharidů v reálném vzorku nealkoholického piva před a po enzymatickém štěpení. Z jejich porovnání je zřejmý nárůst koncentrace glukosy způsobený více jak 95 % konverzí sacharidů. Jelikož je enzymatické štěpení proces dynamický, v okamžiku jeho přerušení v roztoku zůstávají zbytkové DP oligomery, a i když představují minoritní část, musí být zahrnuty do výpočtu celkového obsahu sacharidů. Při výpočtu celkové koncentrace sacharidů je dále provedena korekce na změnu objemu vzorku přidáním roztoku enzymu (dle použitých objemů) a korekce na účinnost enzymu v závislosti na obsahu alkoholu (tab. 1).

Obr. 1 Chromatogram reálného vzorku nealkoholického piva před enzymatickým štěpením

Obr. 2 Chromatogram reálného vzorku nealkoholického piva po enzymatickém štěpení

Tab. 1 Koeficient výtěžnosti v závislosti na obsahu alkoholu (% obj.)

Účinnost enzymu amyloglukosidasy je pravidelně ověřována pomocí přídavku známé koncentrace maltodextrinu (4 g/100 ml) do nealkoholického piva. Enzymaticky jsou štěpeny původní nealkoholické pivo a nealkoholické pivo s přídavkem maltodextrinu a u obou je změřen celkový obsah sacharidů po štěpení. Rozdíl obou hodnot vyjádřený v procentech vzhledem k hodnotě přídavku maltodextrinu (100 %) vyjadřuje účinnost štěpení.

2.3 Kvantifikace oligomerů DP3 až DP10

Vzhledem ke špatné dostupnosti a vysoké ceně standardů oligomerů, jsou koncentrace oligomerů DP3-DP10 vyhodnoceny pomocí standardu maltosy a získané hodnoty koncentrací jsou pak násobeny relativními odezvovými faktory vzhledem k maltose pro jednotlivé oligomery, získané samostatným měřením pro všechny oligomery včetně maltosy metodou standardního přídavku. Pro DP3 byl získán faktor 1,1; pro DP4 1,3. Vzhledem k nízké koncentraci oligomerů DP5 – DP10 a jejich rozpětí odezvových faktorů v úzkém rozmezí 1,4–1,6 byla hodnota faktoru pro tyto analyty aproximována na hodnotu 1,5.

2.4 Výpočty

Pro výpočet koncentrací jednotlivých sacharidů v pivu, sladině nebo mladině, tj. bez enzymatického štěpení, použijeme následující rovnici

c(p, s, m) = cx . d

kde c(p, s, m) je koncentrace jednotlivého sacharidu v pivu, sladině nebo mladině, cx je změřená koncentrace jednotlivého sacharidu a d je příslušné ředění.

Celkový obsah monosacharidů a oligosacharidů DP2 až DP10 v pivu, sladině nebo mladině bez štěpení, je potom součtem zjištěných koncentrací

c(p, s, m) = Σcxi . d

kde c(p, s, m) je koncentrace všech sacharidů v pivu, sladině nebo mladině, cx je změřená koncentrace každého sacharidu a d je příslušné ředění.

Laboratorní postup enzymatického štěpení sacharidů v pivu pro zjištění celkové koncentrace sacharidů, tj. i těch v pivu přítomných ve formě polysacharidů a glycerolu, v sobě zahrnuje kroky, které jsou zohledněny ve výpočtu odpovídajícími korekčními faktory:

cp = Σcxi . d . e / f

kde cp je celkový obsah sacharidů v pivu včetně glycerolu, cxi je změřená koncentrace jednotlivých sacharidů a glycerolu, d je příslušné ředění, e je korekční faktor změny objemu po přídavku roztoku enzymu a f je korekční faktor účinnosti enzymu, jehož hodnota závisí na obs ahu alkoholu v objemových procentech (viz tab. 1).

2.5 Validační parametry

Validační parametry metody, opakovatelnost (r95), limit kvantifikace přístroje (ILOQ), limit kvantifikace metody (MLOQ) a variační koeficient při koncentraci MLOQ a deseti opakováních (CV) je pro jednotlivé sacharidy uveden v tab. 2.

Tab. 2 Validační parametry metody

3 OVĚŘENÍ METODY

Pro ověření správnosti metody bylo použito srovnání celkové koncentrace sacharidů s reálným extraktem piva, který je tvořen právě sacharidy, dále bílkovinami, organickými kyselinami, minerálními látkami a dalšími minoritními sloučeninami (podrobné informace o nutričním složení piva budou zveřejněny v následném článku Olšovská et al: Energetická hodnota piva, který vyjde srpnu 2018).

V tab. 3 je uveden přehled srovnávaných vzorků, 10 nealkoholických (vzorky 1–10) a 10 alkoholických (vzorky 11–20) piv.

Tabulka 3 Srovnání výsledků celkových sacharidů a skutečného extraktu

V nealkoholických pivech byl nalezen obsah celkových sacharidů od 3,07 do 7,53 g/100 ml s odpovídajícím rozpětím extraktu od 3,17 do 7,94 %. To odpovídá 90,5 až 97,9 % skutečného extraktu s průměrnou hodnotou 94,3 %. Obsah celkových sacharidů v alkoholických pivech se pohyboval v rozmezí 3,19 až 4,35 g/100 ml s odpovídajícím extraktem 3,44 až 5,02 %. Sacharidy v těchto alkoholických pivech tedy představují 86,5 až 92,7 %. Vyšší procento sacharidů v extraktu v nealkoholických pivech je způsobeno nižším stupněm prokvašení, procentní obsah ostatních sloučenin je pak nižší než u běžného alkoholického piva. Vzhledem k těmto výsledkům lze konstatovat, že metoda poskytuje správné výsledky (Jurková et al., 2014).

4 APLIKACE METODY, MONITORING CUKRŮ A SACHARIDŮ V ČESKÝCH PIVECH

VÚPS metodiku stanovení cukrů a sacharidů pro nutriční značení piva provádí již od roku 2012, v roce 2013 byla akreditována Českým institutem pro akreditaci podle normy ISO EN 17025, v roce 2014 byla metodika publikována v zahraničním recenzovaném časopise Food Analytical Methods (Jurková et al., 2014) a certifikována Úřadem pro potraviny na Ministerstvu zemědělství ČR. Řada českých pivovarů již rutinně využívá metodu stanovení sacharidů a cukrů pro značení těchto hodnot na etiketách. Získaná data za období 2016 a 2017 byla statisticky zpracována a vyhodnocena.

4.1 Stanovení profilu oligosacharidů ve sladině

Na obr. 3 je profi l sacharidů do DP10, kterou lze provést popsanou HPLC metodou bez předchozího enzymatického štěpení. Tato metoda je vhodná pro určení sacharidického složení sladiny nebo mladiny, zejména z důvodu obsahu zkvasitelných cukrů. Po integraci chromatografických píků uvedeného příkladu získáme hodnoty cukrů a oligosacharidů uvedených v tab. 4. Výsledná koncentrace sacharidů 8,58 g/100 ml udává koncentraci do DP 10.

Obr. 3 Separace dextrinů DP10 ve sladině (bez enzymatického štěpení)

Tab. 4 Hodno ty sacharidů v modelových vzorcích

4.2 Stanovení celkových sacharidů a z toho cukrů v pivu

Pro potřeby stanovení celkových sacharidů a z toho cukrů, zejména pro nutriční značení piva, se používá následující postup. Nejdříve se změří obsah cukrů v pivu bez štěpení, originální pivo se pouze naředí a stanoví se obsah glukosy, fruktosy a maltosy a tyto tři hodnoty se sečtou. Zároveň je stanoven glycerol. Takto získáme hodnotu cukrů. Příklad analýzy je uveden na obr. 1 a příslušné hodnoty jsou uvedeny v tab. 4. V druhém kroku je pivo enzymaticky štěpeno a zhruba 95 % všech sacharidů je převedeno na glukosu. Pomocí HPLC stanovení je zjištěn obsah vzniklé glukosy a připočten obsah zbytkových nerozštěpených sacharidů, čímž získáme hodnotu celkových sacharidů. Příklad HPLC analýzy celkových sacharidů je uveden na obr. 2 a příslušné hodnoty jsou uvedeny v tab. 4.

Z tab. 4 je zřejmé, jak velká část sacharidů s vyšším polymeračním stupněm nad DP10 je v pivu obsažena. Pokud sečteme separované sacharidy v pivu, které nebyl o štěpeno, získáme v našem konkrétním příkladu hodnotu 3,35 g/100 ml. Pokud provedeme enzymatické štěpení, celková hodnota sacharidů je 4,55. Rozdíl mezi těmito hodnotami, tedy 1,20 g/100 ml, je koncentrace sacharidů nad DP10, které, jak je vidět, nelze z nutričního hlediska zanedbat, neboť tvoří 26 % celkové koncentrace sacharidů. Tento rozdíl je platný pro všechna piva, lze konstatovat, že zhruba 30 % tvoří v pivu sacharidy s vyšším stupněm polymerace než DP10.

5 ZÁVĚR

Metodu stanovení sacharidů pomocí HPLC s RI detekcí na chromatografické koloně s iontovou výměnou v Ag+ cyklu lze využít pro stanovení cukrů i sacharidů v pivu, sladině i mladině s následujícími možnostmi využití. První aplikace, která poskytuje informaci o účinnosti rmutování, je stanovení profilu zkvasitelných cukrů a oligosacharidů ve sladině a mladině. V tomto případě je vzorek pouze vhodně naředěn a ihned chromatograficky analyzován. Pokud chceme znát koncentraci cukrů a glycerolu v pivu pro nutriční značení piva, použijeme metodu stejným způsobem. Konečně pro zjištění celkové koncentrace sacharidů v pivu pro nutriční značení provedeme enzymatické štěpení na glukosu a tu pak stanovíme metodou HPLC-RI. Metoda je dobře opakovatelná, má dobrou výtěžnost a v rámci mezilaboratorních testů poskytuje výborné výsledky.

Kvasný průmysl
 

Mohlo by Vás zajímat

Metabolome Analysis of Hydrophilic Metabolites in Saliva Using LCMS™-8060NX Triple Quadrupole Mass Spectrometer

Aplikace
| 2017 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Metabolomika

A Predictive Compound Database Approach to the Tentative Identification and Semiquantitation of Volatile-Phenol Glycosides in Smoke‑Affected Grapes from Wildfires

Aplikace
| 2019 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Discovery of the Potential Marker Compounds for Stored White Tea by a Metabolomics Approach

Aplikace
| 2019 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Potraviny a zemědělství, Metabolomika
 

Podobné články

Další projekty
Sledujte nás
Další informace
WebinářeO násKontaktujte násPodmínky užití

LabRulez s.r.o. Všechna práva vyhrazena.