Přímá analýza vod pomocí ultra-citlivé LC/MS/MS: přednosti i možná úskalí

Nejčastěji se sledují farmaka, pesticidy a jejich metabolity, nicméně měří se i rezidua z kosmetiky, čisticích přípravků a látky uvolňující se třeba ze stavebních materiálů, polymerů atd. Jde o skutečně široké spektrum látek s velmi odlišnými fyzikálně-chemickými vlastnostmi. Řada vědeckých studií ukázala, že se tyto látky přes čističky odpadních vod dostávají do řek a následně do zdrojů pitné vody. Zmíněné kontaminanty se ve vodách vyskytují ve velmi nízkých koncentracích (jednotky až stovky ng/l), takže analýza obvykle vyžaduje zakoncentrování vzorku na SPE, aby analyty mohly být detekovány běžnými LC/MS systémy. Pro SPE je však potřeba velký objem vzorku (stovky mililitrů) a je především časově, ale i finančně náročná. Kromě toho, velmi polární analyty se slabou retencí na reverzní fázi poskytují nízké výtěžnosti a je proto potřeba použít několik různých typů SPE kolonek.

1. Online SPE

Alternativou může být použití automatizovaného online-SPE, kdy lze na speciální SPE kolonku nastříknout velký objem vzorku (až několik ml) a přepnutím ventilu automaticky eluovat zadržené analyty přímo na kolonu. Oproti klasické offline SPE je celý alikvot vzorku vnesen na kolonu. Z pohledu chromatografické separace u online SPE dochází k rozmytí elučních zón vlivem vysokého objemu nástřiku a také příspěvkem mrtvých objemů přepínacího ventilu, kapilár a SPE kolonky. Porovnání online-SPE a přímého nástřiku vyznívá z hlediska citlivosti (absolutní množství analytu na kolonu) lehce pro přímý nástřik (1). Online SPE, podobně jako klasické SPE neumožňuje spolehlivě řešit velmi polární analyty s malou retencí a ve srovnání s offline-SPE je na výběr užší spektrum fází. Také faktor zakoncentrace je obvykle nižší než u běžného SPE. I přes výše uvedená omezení je však online-SPE možným řešením pro robustní a automatizovanou analýzu vod (2-4).

2. Přímá analýza

Ideálním scénářem pro analýzu vod je přímý nástřik bez jakékoli předúpravy. S rozvojem technologií LC/MS a s příchodem ultra-citlivého LC/MS trojitého kvadrupólu Agilent 6495 QQQ již toto řešení nabylo realistického rozměru, protože přímým nástřikem vzorku na analytickou kolonu lze požadovaných limitů detekce pro kontaminanty ve vodě dosáhnout. Použití takových metod se odrazí ve vyšší produktivitě i nižších nákladech na vzorek, možností současné analýzy látek s širokým rozpětím polarit a také jsou eliminována rizika kontaminace vzorku během zakoncentrování na offline nebo online SPE.

Analýza ultrastopových koncentrací kontaminantů (v řádu jednotek až desítek fg na kolonu) s sebou však přináší nejen vysoké nároky na analytický systém, ale i na pracovní postupy, čistotu prostředí, použitých rozpouštědel, chemikálií, skla (láhve, frity) a kvalitu spotřebního materiálu. Při zavádění takových metod začínají svou roli hrát i jevy, které dříve neměly podstatný vliv na výsledek. Cílem následujících odstavců jeshrnout klíčové faktory ovlivňující kvalitu výsledků při sledování velmi nízkých hladin analytů. Všechna níže uvedená data pocházejí z měření provedených na LC/MS systémech instalovaných v České republice.

3. Faktory ovlivňující meze detekce a kvalitu výsledků při přímé analýze vod

a. Objem nástřiku

Vliv objemu nástřiku na meze kvantifikace dokumentuje Tabulka 1. Při zvyšování objemu nástřiku se koncentrace LOQ nesnižuje ruku v ruce se zvyšujícím se alikvotem vzorku na kolonu. Například pro ß-estradiol při 45násobně vyšším objemu nástřiku klesl dosažený limit kvantifikace pouze 15krát. Vyšší objem nástřiku totiž negativně ovlivňuje chromatografickou separaci a tvar píku, protože nedochází ke kvalitní fokusaci zóny analytů na hlavě kolony. Objem nástřiku 100 μl se ukazuje být pro UHPLC dobrým kompromisem, kdy jsme schopni převést na kolonu dostatečné množství vzorku, aniž by chromatografická separace příliš trpěla. Menší objem nástřiku (zmíněných 100 μl) má pozitivní vliv i na životnost kolony a robustnost LC/MS přístroje.

Tabulka 1: Porovnání objemu nástřiku a dosažených limitů kvantifikace pro ß-estradiol. Objem nástřiku koresponduje s objemem smyčky, tj. vždy se nastřikoval plný objem smyčky. Všechny podmínky kromě objemu nástřiku byly identické.

b. Kvalita pufrů a rozpouštědel

Při použití ultra-citlivé instrumentace je nutno používat nejvyšší kvalitu pufrů a rozpouštěl z důvodu minimalizace chemického šumu. U méně citlivého LC/MS systému by chemický šum, který způsobí pufr o nižší čistotě, nebyl ani detekován. V případě ultra-citlivých systémů, jako je Agilent 6495, šum detekován je a zhoršuje tak dosažitelné limity detekce, které se vlivem nevyhovující čistoty chemikálií mohou zhoršit i řádově.

c. Kontaminace cílovými analyty

Dalším problémem, který souvisí s analýzou vod, je kontaminace cílovými analyty. Častým problémem v environmentální analýze jsou perfluorované karboxylové kyseliny (nejznámější z nich je PFOA – perfluorooktanová kyselina), které se vymývají z teflonových částí HPLC systému (hadičky, membrána degasseru atd.). Existuje však celá řada dalších analytů (ibuprofen, kofein, carbamazepin, salicylová kyselina, acetaminofen, některé pesticidy, umělá sladidla, bisfenol A atd.), které jsou často přítomny ve vodovodním řádu (obvykle se kvůli těmto látkám monitoring vod dělá) a vstupují i do deionizační jednotky a posléze do mobilní fáze. Během rekondicionace kolony potom dochází k akumulaci těchto látek na hlavě kolony a s gradientem další analýzy jsou vymyty přesně ve stejný okamžik, jako analyt ze vzorku. Čím citlivější LC/MS systém máme, tím představuje kontaminace mobilní fáze palčivější problém.

Bohužel praxe ukazuje, že ani kupovaná voda pro LC/MS není prostá těchto látek. Prakticky jediným řešením je vložení „trapovací“ kolonky (obvykle C18) mezi pumpu a autosampler. Na trapovací kolonce se zachytí kontaminace z LC systému a mobilní fáze, takže jsme schopni ji oddělit od analytu pocházejícího ze vzorku. Na Obrázku 1 je ukázka z analýzy PFOA, kde je vidět analyt z nástřiku a kontaminace z LC systému. Přestože ani voda v laboratoři použitá pro přípravu mobilní fáze nebyla zcela bez PFOA, hlavní část kontaminace pochází skutečně z plastových hadiček LC. Na Obrázku 2 je obdobná situace s kontaminací, ale z nástřiku čisté vody je zřejmé, že obsahuje cílové analyty.

Obrázek 1: Ukázka kontaminace PFOA z UHPLC systému a rozpouštědel. Záchyt a pozdržení kontaminace na trapovací kolonce je nezbytné pro měření nízkých koncentrací PFOA.

Obrázek 2: Ukázky měření analytů často přítomných ve vodě pro přípravu mobilní fáze. Konfigurace s trapovací kolonkou. Horní řada: chromatogram samotného pozadí bez nástřiku, Prostřední řada: nástřik 100 μl čisté vody. Dolní řada: nástřik standardu 1 ng/l připravený z jiné vody, bez kontaminace. Spektrum a koncentrace analytů se liší nejen podle zdroje vody, ale i během roku.

V případě použití SPE se může případná kontaminace PFOA a jinými analyty pocházejícími z plastu zvýšit, protože se mohou uvolňovat z materiálu kolonek nebo hadiček apod.

d. Sorpce analytů na stěny vialky

Dalším jevem, který je třeba vzít v potaz při analýzách vody přímým nástřikem, jsou ztráty analytů z důvodu sorpce na aktivní místa na povrchu vialky. Při přípravě vzorků pomocí SPE je sorpce analytů minimální, protože SPE se obvykle provádí v plastu a do vialky se převádí až zakoncentrovaný vzorek, ve kterém je kromě vyššího množství analytu i větší množství matrice. Ta obsadí aktivní místa ve vialce a ke ztrátě analytů prakticky nedochází.

Riziko však nastává při přímé analýze polárních analytů v čistých vzorcích jako je pitná voda. Řešením je použití kvalitních skleněných vialek nebo vialek plastových. Na Obrázku 3 je pro vybrané analyty porovnání odezvy při převedení stejného vzorku do skleněné a plastové vialky. Je patrné, že sorpce na stěny skleněné vialky má souvislost se strukturou analytu, jeho polaritou a funkčními skupinami. Vliv sorpce na kvantifikaci je dokumentován na Obrázku 4 pro atrazin-desethyl-desisopropyl na kalibračních křivkách získaných ze skleněných a plastových vialek. Vliv sorpce začíná být patrný až na koncentračních hladinách pod 10 ng/l.

Obrázek 3: Porovnání odezvy vybraných analytů ve skleněné a plastové vialce

Obrázek 4: Kalibrační křivky analytu atrazin-desethyl-desisopropyl (1 – 1000 ng/l) připravené do skleněných a plastových vialek. V případě skleněných vialek lze jasně pozorovat ztrátu analytu způsobenou sorpcí.

4. Výhody metod s přímým nástřikem vody a dosahované meze detekce

I přes výše popsaná úskalí, která je třeba vést v patrnosti, přináší využití přímé analýzy vod celou řadu benefitů. Kromě výše zmíněné vyšší rychlosti analýzy a nižším nákladům umožní přidat do metody analyty, které by se jinak musely kvůli vysoké polaritě měřit odděleně. Jedním z takových analytů je chloridazon-desfenyl, degradační produkt chloridazonu, často používaného herbicidu, který má velmi malou retenci na SPE s reverzní fází. Protože analytická kolona je mnohem delší než SPE kolonka a protože se nastřikuje relativně malý objem, stačí i slabá retence chloridazon-desfenylu pro dosažení LOQ na koncentraci 0,5 ng/l (ppt). Podobným případem velmi polárního analytu je také iopamidol (kontrastní látka pro RTG vyšetření), nebo desethyl-desisopropyl atrazin (degradační produkt atrazinu).

Obrázek 5 dokumentuje detekci těchto tří analytů v reálných měřeních. Pro analyty, které mají na reverzní fázi vyšší retenci, nepředstavuje přímý nástřik vzorků vod z pohledu chromatografie žádný problém, jak dokumentuje obsáhlá aplikační poznámka věnovaná analýze látek z produktů pro osobní péči (5). Jedinou limitaci může představovat kombinace relativně malého objemu nástřiku s nízkou citlivostí v ESI. S tímto problémem se typicky setkáváme u analytů ionizujících v negativním módu jako je ibuprofen, dicamba nebo steroidní hormony. V těchto případech se však využije vysoká citlivost LC/MS systému Agilent 6495, který i pro tyto problematické analyty dosahuje z přímého nástřiku velmi dobré citlivosti v řádu jednotek ng/l (ppt) (viz Obrázek 6).

Obrázek 5: Ukázky chromatogramů polárních analytů (A) iopamidol (0,2 ng/l); (B) desfenylchloridazon (0,5 ng/l); (C) atrazin-desethyl-desisopropyl (1 ng/l). Přímý nástřik 100 μl, LC/MS systém Agilent 6495.

Obrázek 6: Problematické analyty ionizující v ESI- na úrovni LOQ: (A) dicamba (0,5 ng/l); (B) ibuprofen (0,5 ng/l); (C) betaestradiol (1 ng/l). Přímý nástřik 100 μl, LC/MS systém Agilent 6495.

Instrumentální meze detekce (princip stanovení Instrumentální meze detekce - viz článek v Chromatomol 2), které jsme dosáhli během našich experimentů a demo měření pro zákazníky, shrnuje Tabulka 2. Je vidět, že přímý nástřik 100 μl vzorku s využitím utracitlivého LC/MS Agilent 6495 dosahuje pro většinu analytů mezí detekce typicky desetin ppt, pro obtížně ionizující analyty jednotek ppt a naopak setin ppt pro dobře ionizující látky. Díky tomu tento přístroj s danou metodikou vyhovuje pro sledování celé řady analytů a splňuje legislativní požadavky pro monitoring v pitných i povrchových vodách.

Tabulka 2: Dosažené instrumentální meze detekce (IDL)

Závěr

Rozvoj instrumentace v oblasti LC/MS/MS v posledních letech umožňuje převést metodiky využívající SPE předúpravu vody na postupy s přímou analýzou. To dovoluje vyšší produktivitu laboratoře, větší škálu současně stanovovaných sloučenin, včetně těch velmi polárních, které jinak vyžadují oddělené metodiky. Použitím přímé analýzy také eliminujeme také rizika kontaminace během přípravy vzorku.

Kromě samotné analytické instrumentace je však třeba vzít v potaz další faktory, které na takto nízkých koncentračních hladinách začínají hrát významnou roli. K nim patří čistota chemikálií, skla a laboratorního prostředí. Problémy mohou nastat kvůli kontaminaci vody pro přípravu mobilní fáze cílovými analyty nebo sorpcí analytů na sklo na ppt hladinách.

Pomocí LC/MS/MS Agilent 6495 lze dosáhnout mezí detekce pro většinu analytů na úrovni desetin ppt a splnit tak požadavky legislativy pro analýzu vod pomocí přímé analýzy bez jakékoli SPE zakoncentrace.