Stanovení rebaudiosidu A v ochucených pivech, nápojích na bázi piva a limonádách

Stevie sladká se stává oblíbeným sladidlem v potravinářském průmyslu. Sladkou chuť způsobují diterpenické sloučeniny tzv. steviol glykosidy, které jsou nekalorické a mají sladivost asi 300 vyšší než sacharosa. Pouze derivát rebaudiosid A má přijatelné senzorické vlastnosti, ostatní analogy jsou nahořklé až nepříjemně hořké. Jelikož se toto sladidlo používá také k doslazování nápojů včetně oblíbených ochucených piv, byla vyvinuta rychlá rutinní analytická metoda stanovení rebaudiosidu A v těchto nápojích a limonádách pomocí kapalinové chromatografi e s UV detekcí. Pro separaci steviol glykosidů bylo využito HILIC principu, který je vhodný pro velmi polární a hydrofi lní analyty. Metoda je selektivní, dobře opakovatelná a má vysokou výtěžnost 90–100 %.

1 ÚVOD

Stevie sladká (Stevia rebaudiana) pochází z Jižní Ameriky, je hojně rozšířena také v Asii, zejména v Japonsku, a je užívána jako přírodní nekalorická náhrada sacharózy.

V roce 1931 izolovali francouzští chemici z listů rostliny základní glykosidy steviosid a rebaudiosid A. Jedná se o diterpenické sloučeniny s vysokou sladivostí až 300x vyšší než má sacharosa. Tyto látky jsou obsaženy i v ostatních částech rostliny s výjimkou kořenů. Podíl steviosidu činí cca 10 % a rebaudiosidu A 2–4 % v suchých listech. Listy stevie obsahují další diterpenické sloučeniny, avšak v nižším zastoupení. Obvykle je v listech přítomno osm steviol glykosidů: steviosid, steviolbiosid, rebaudiosid (A, B, C, D, E) a dulcosid A. Diterpenické steviol glykosidy chutnají nahořkle, s výjimkou rebaudiosidu A, který má hořkost minimální. Nejvíce produkovaný steviosid vykazuje znatelnou, někdy až nepříjemnou hořkost (Prakash et al., 2008), a proto je v potravinářském a nápojářském průmyslu využíván pouze extrakt rebaudiosidu A. Jeho extrakty se mohou lišit obsahem i čistotou výsledného produktu v závislosti na původu rostliny a podmínkách extrakčního postupu. Kromě steviol glykosidů mohou být v extraktech stevie přítomny i látky, které žádnou sladkost nevykazují.

Celosvětový trend „znovuobjevení stevie“ jako potravinového doplňku znamenal překonání řady předsudků a překážek ze strany lobbistických skupin, neboť stevie se stala vážným konkurentem dosud používaných umělých sladidel. FDA úřad pro kontrolu potravin a léčiv v USA teprve v roce 1995 uznal stevii jako doplněk stravy. Do té doby směla být používána pouze v kosmetickém průmyslu, ačkoli její bezpečné užívání bylo známo více jak 1500 let. Postoj FDA byl ovlivněn zejména zavádějícími studiemi profesora Mauro Alvareze z Brazílie z roku 1988, které stevii připisoval antikoncepční vlastnosti, dokonce neplodnost mužů i žen. Musela být proto provedena řada studií, která tento mýtus vyvrátila. Téměř o 40 let bylo proto zdrženo odsouhlasení FDA stevie jako běžného sladidla, které nevykazuje žádný kontraceptivní efekt. Ani žádné další nejmodernější studie vliv na infertilitu nepotvrdily (Kumar et al., 2008).

Také v Evropské unii předcházela uznání stévie jako přídatné látky do potravin s označením E960 řada diskuzí a studií, které byly ve svých postojích značně nejednotné. Teprve od 2. prosince 2011 byly steviol glykosidy v EU registrovány jako povolené náhradní sladidlo. Toto schválení se vztahuje na rebaudiosid A s obsahem nejméně 95 % čisté látky a na směsi steviol glykosidů s celkovým obsahem rovněž vyšším než 95 %.

Podle společného výboru expertů pro potravinářská aditiva (JEFCA) Světové zdravotnické organizace (WHO) a Organizace OSN pro výživu a zemědělství (FAO) je přijatelný denní příjem pro steviol glykosidy vyjádřený jako ekvivalent steviolu 4 mg na kg tělesné hmotnosti a den (US Food and Drug Administration, 2008, JEFCA 2008). Jako nekalorické sladidlo si rebaudiosid A našel cestu do všech odvětví potravinářského průmyslu, v nápojovém průmyslu se využívá zejména ke slazení limonád a sirupů. V poslední době se stále častěji objevují na trhu piva ovocná, v nichž právě rebaudiosid A našel velké uplatnění. Jeho mírně nahořklá chuť velmi dobře ladí s hořkým charakterem piva, a proto rebaudiosid A stále častěji nahrazuje umělá sladidla, např. aspartam.

Nejrozšířenější metodou pro stanovení steviol glykosidů je HPLC, existuje také několik metod využívajících techniku tenkovrstvé chromatografie, kapilární elektroforézy nebo některé spektroskopické metody (NIR, VIS). Výběr separačních podmínek v HPLC je závislý na polárních vlastnostech glykosidů, při volbě UV detekce je rozsah použitelných absorpcí zúžen na oblast krátkých vlnových délek. Přehled původních metod používaných pro stanovení steviol glykosidů shrnuje práce z roku 1998 (Bovanová, 1998). Zveřejněné metody HPLC popisují separaci steviol glykosidů zejména na chromatografických kolonách s funkčními skupinami NH2 nebo C18, mobilní fázi tvoří většinou acetonitril nebo methanol v různém poměru s vodou. Optimalizaci podmínek pro získání rebaudiosidu A z listů stévie pomocí Soxhlet extraktoru s následným HPLC stanovením na koloně C18 s mobilní fází acetonitril/voda 80/20 (v/v) popisuje práce autorů Afandi et al. (Afandi, 2013). Přípravu kapalných vzorků na SPE (Solid Phase Extracion) fázi před HPLC analýzou publikovali Bovanová et al. (1998).

V současné době je pro separaci velmi polárních a hydrofilních sloučenin používána nová technika, založená na principu hydrofilních interakcí v kapalinové chromatografii (HILIC). Alpert (Alpert, 1990) navrhl označení „chromatografie hydrofilních interakcí“ (HILIC) pro chromatografii na kolonách typických pro systémy s normálními fázemi, které ale využívají vodně-organické mobilní fáze podobně jako RP systémy. Slovo „hydrofilní“ charakterizuje afinitu k vodě, která se přidává do mobilních fází při HILIC separacích na polárních kolonách. HILIC technika nalezla nejprve uplatnění při separacích sacharidů, aminokyselin a peptidů (Strege, 1998), v posledních letech ale rychle roste počet nově vyvinutých nových kolon pro HILIC a aplikací pro separace v oblasti analýz životního prostředí, potravin, přírodních látek i syntetických léčiv, iontových i neiontových tenzidů. Významnou výhodou HILIC separací je zvýšená citlivost analýz pomocí kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí díky zlepšené ionizaci elektrosprejem (ESI) v mobilních fázích s vysokým obsahem acetonitrilu (Brown et al., 2002; Jandera, 2011).

Tohoto principu lze využít pro HILIC separaci steviol glykosidů s UV detekcí (Thermo, 2012). Při použití ELS detektoru (Evaporative Light Scattering) lze dosáhnout oproti detekci UV zlepšení meze detekce a kvantifikace. Nevýhodou tohoto detektoru je však nutné použití těkavé mobilní fáze.

I když v odborné literatuře již existuje řada metod pro stanovení rebaudiosidu A a ostatních steviol glykosidů, existuje jen málo potravinářských laboratoří, kde se tato metoda rutinně provádí. To se odráží v ceně této analýzy. Proto bylo cílem této práce vypracování analytické metody stanovení rebaudiosidu A (obr. 1) v pivu a limonádách pomocí dostupné techniky HPLC s UV detekcí s využitím separačního principu HILIC. Struktura rebaudiosidu A s převažujícími -OH skupinami svědčí o její vysoké polaritě. Pravděpodobná hodnota logaritmu rozdělovacího koeficientu mezi vodu a oktanol (log P) je – 3,12. Hodnoty menší než 1 charakterizují polární sloučeniny (poznámka autora, viz. Dictionary of Food Compounds with CD-ROM, 2004).

Obr. 1 Struktura rebaudiosidu A

2 MATERIÁL A METODY

2.1 Chemikálie a rozpouštědla

• Rebaudiosid A, HPLC standard >96 % (Sigma-Aldrich)
• Deionizovaná voda, obsah organických látek < 4 ppb (Millipore, USA)
• Acetonitril, Chromasolv, gradient grade pro HPLC > 99,9 %, Sigma Aldrich
• Methanol, Chromasolv, gradient grade pro HPLC > 99,9 %, Sigma Aldrich
• Stříkačkové fi ltry celulosové s pórovitostí 0,2 μm (SISw, Praha)

2.2 Příprava vzorků

Vzhledem k vyšší koncentraci rebaudiosidu A v limonádách jsou tyto vzorky před analýzou pouze předčištěny. Vzorky piv s mnohem nižším obsahem sladidla je nezbytné také zakoncentrovat, a to tak, aby se měřené hodnoty pohybovaly v oblasti kalibrační křivky rebaudiosidu A. Pro čištění i zakoncentrování rebaudiosidu A byly použity extrakční kolonky C18, E 1000 mg/6 ml (Strata, Phenomenex, USA). Extrakční kolonka byla nejprve kondicionována (postupně 10 ml methanolu, 10 ml deionizované vody), poté byl na kolonku nanesen vzorek limonády (5 ml) nebo piva (25 ml). Zachycený vzorek na adsorbentu byl promyt (10 ml 20% acetonitrilu v deionizované vodě) a konečně eluován do směsi acetonitril – methanol v poměru 1:1 (v/v) o objemu 5 ml. Přečištěný vzorek byl po fi ltraci na celulosovém filtru (pórovitost 0,2 μm) nadávkován na kolonu (5 μl).

2.3 Příprava kalibračních roztoků

Rozsah kalibrační křivky byl zvolen tak, aby vyhovoval stanovení rebaudiosidu A jak v limonádách, tak v ochucených pivech s nižší koncentrací než 1 mg/l (takové vzorky jsou prekoncentrovány). Kalibrační roztoky byly připraveny rozpuštěním standardu do mobilní fáze. Zásobní roztok rebaudiosidu A byl připraven navážením 100 mg s přesností ± 1 mg standardu rebaudiosidu A a rozpuštěním ve 100 ml odměrce. Kalibrační roztoky o koncentracích 1, 5, 10, 20 a 50 mg/100 ml analytu byly připraveny ředěním příslušných objemů zásobního roztoku mobilní fází.

2.4 HPLC stanovení

Pro stanovení rebaudiosidu A byla použita metoda kapalinové chromatografi e s UV detekcí při 210 nm na kapalinovém chromatografu Dionex Ultimate 3000 (Thermo Scientifi c) vybaveným ovládacím a procesovacím softwarem Chromeleon 7.

Pro separaci polárního rebaudiosidu A od ostatních látek přítomných v matricích piva i limonády byla použita kolona Acclaim Mixed – Mode WAX 1(2,1 x 150 mm; 5 μm; Thermo Scientifi c) v HILIC modu.

Mobilní fáze byla tvořena acetonitrilem a 10 mM mravenčanem amonným o pH 3,00 ±0,05 v poměru 80/20 (v/v) v izokratickém režimu. Průtok mobilní fáze byl 0,5 ml/ min, kolona byla termostatována při 40 °C, nástřik vzorku byl 5 μl.

Obr. 2 Chromatogram separace vzorku piva obsahující rebaudiosid A.jpg

Kolona Acclaim Mixed – Mode WAX 1(2,1 x 150 mm; 5 μm), mobilní fáze acetonitril a 10 mM mravenčan amonný 80/20 (v/v) v izokratickém režimu. Průtok mobilní fáze 0,5 ml/ min, teplota kolony 40 °C, nástřik vzorku 5 μl. Retenční čas rebaudiosidu A 9,75 min

3 VÝSLEDKY A DISKUSE

Metoda byla optimalizována pro matrice pivo a limonády, v rámci validace byla ověřována linearita metody, její opakovatelnost a výtěžnost.

3.1 Selektivita

Jak vyplývá z obr. 2, eluční zóna rebaudiosidu A je zřetelně oddělena od ostatních polárních analytů, a to i v případě velmi nízké koncentrace ve vzorku. Poslední minoritní složka eluuje v čase 7,04 min, eluční zóna rebaudiosidu A až v čase 9,75 min. Úplná separace rebaudiosidu A od ostatních složek vyhovuje podmínkám dobré selektivity metody. Tato skutečnost je dána použitým HILIC módem, která má výrazně lepší selektivitu k polárním látkám, a tedy rebaudiosidu A, ve srovnání s běžnými nepolárními kolonami. Další výhodou HILIC módu je vyšší citlivost, neboť pro hydrofi lní analyty je ve srovnání s reversními technikami 10 až 1000 x vyšší.

3.2 Linearita

Linearita byla ověřena v uvedeném kalibračním rozsahu 1 – 50 mg/100 ml, kde má prokazatelně odezva detektoru lineární závislost na koncentraci rebaudiosidu A.

Z tab. 1 je zřejmé, že hodnoty koncentrace rebaudiosidu A se v původním vzorku ochuceného piva pohybují v těsné blízkosti spodního bodu kalibrační závislost.

3.3 Opakovatelnost a výtěžnost metody

Pro zjištění opakovatelnosti a výtěžnosti metody byla použita limonáda typu Cola a pivo ochucené ovocným výtažkem, obojí s deklarovaným obsahem rebaudiosidu A. U obou vzorků byla stanovena koncentrace sledovaného analytu. Každý vzorek byl extrahován na SPE kolonce a následně analyzován na chromatografické koloně. Stanovený obsah rebaudiosidu A v každém vzorku a opakovatelnost stanovení (vyjádřená jako mez opakovatelnosti) jsou uvedeny v tab. 1. Přípustný rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními (mez opakovatelnosti) v případě piva i limonády v původním vzorku činí 0,42 mg/100 ml, což vypovídá o dobré přesnosti metody.

Tab. 1 Opakovatelnost metody

Výtěžnost metody byla zjišťována pomocí standardního přídavku rebaudiosidu A. Ke vzorku limonády a ochuceného piva byl přidán standard rebaudiosidu A o dvou různých koncentracích a z rozdílu před a po přidání byla vypočtena výtěžnost metody. Aby byly eliminovány chyby, které by vznikly dávkováním řádově odlišných objemů při přídavku do ochuceného piva a limonády, byly připraveny standardní roztoky odlišných koncentrací: pro limonádu byl připraven roztok o koncentraci 1000 mg/100 ml, pro pivo o koncentraci 100 mg/100 ml. V obou případech byl přidán standardní přídavek tak, aby se dosáhlo dvou odlišných koncentračních úrovní. Do 100 ml odměrné baňky byl vždy přidán odpovídající objem standardního roztoku a doplněn příslušnou matricí po značku. Do limonády byly dávkovány 1 ml resp. 2 ml standardního roztoku, což znamenalo zvýšení koncentrace analytu v limonádě o 10 resp. 20 mg/100 ml, do piva byly přidány 2 ml resp. 4 ml standardního roztoku, což znamenalo zvýšení koncentrace analytu v matrici piva o 2 resp. 4 mg/100 ml. Na každé koncentrační úrovni bylo stanovení provedeno 2x. Výsledky jsou uvedeny v tab. 2. Výtěžnost metody se pro limonády pohybuje v intervalu 101,9 % až 102,8 %, pro piva mezi 90,2 % až 93,1 %. Tento fakt je zřejmě způsoben větším matričním efektem v pivu a zakoncentrováním piva před analýzou, vzhledem k rozpustnosti tohoto analytu v alkoholu dochází při sorpci a promývání na SPE kolonku k jeho částečnému úniku.

Tab. 2 Výtěžnost metody

Aplikace HILIC techniky umožňuje selektivně oddělit rebudiosid A od ostatních polárních látek i z velmi komplikované matrice piva, což by vzhledem k vysoké polaritě rebaudiosidu A nebylo možné dosáhnout pomocí běžných polárních chromatografických kolon. Eliminace koeluce rebaudiosidu A s jinými složkami vzorku zabezpečuje správnost stanovení bez nadhodnocení výsledku. Ostatní analytické parametry jsou ve shodě s publikovanými metodami s UV detekcí v oblasti krátkých vlnových délek.

4 ZÁVĚR

Vypracovaná metoda pro stanovení rebaudiosidu A poskytuje dostatečně přesné (opakovatelnost 0,42 mg/100 ml) a správné (výtěžnost 90 až 100 %) výsledky. Rozpustnost rebaudiosidu A v alkoholu vysvětluje posun rovnováhy na extrakční kolonce, a tak i nižší výtěžnost z piva ve srovnání s nealkoholickou limonádou. Koncentrace rebaudiosidu A v běžných vzorcích piva a limonády po úpravě na SPE kolonce vyhovují lineární kalibrační závislosti v oblasti od 1 do 50 mg/100 ml analytu.