Přihlášení
Registrace
Nastavení
Filtrování
Filtrování
Obnova hesla
Obnova hesla
Nové trendy v kapalinové chromatografii a jejich využití v analýze piva a pivovarských surovin. Část 1. Teoretický úvod
St, 23.9.2020
| Originální článek z: Kvasný Průmysl
Článek se zabývá pokroky v kapalinové chromatografii. Výhody UHPLC oproti klasické HPLC jsou až devítinásobné zkrácení doby analýzy, dvojnásobné zlepšení rozlišení a trojnásobné zlepšení citlivosti.

Pixabay/nurfayozagzamov1004: Nové trendy v kapalinové chromatografii a jejich využití v analýze piva a pivovarských surovin. Část 1. Teoretický úvod

V souvislosti se zvyšujícími se nároky na rychlost analýz v analytických laboratořích dochází k neustálému zlepšování instrumentálních technik. Článek se zabývá pokroky v nejrozšířenější separační technice, a to v kapalinové chromatografii. Její zcela nová modifikace, ultra účinná kapalinová chromatografie (UHPLC), využívá principu separace na porézních částicích menších než 2 μm. Výhody UHPLC oproti klasické HPLC jsou až devítinásobné zkrácení doby analýzy, dvojnásobné zlepšení rozlišení a trojnásobné zlepšení citlivosti. To vede nejen k ohromné úspoře času, ale také nákladů na energii a organická rozpouštědla a jejich ekologickou likvidaci. Alternativou k UHPLC technice je použití kolon s povrchově porézními částicemi nebo kolon monolitních. UHPLC již našla své uplatnění také v pivovarské analytice.

1 ÚVOD

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) patří mezi nejvíce rozšířené separační techniky běžně využívané v oblastech, jako jsou farmakologie, toxikologie, klinická analýza, dále v různých vědních oborech (Stroh et al. 2008, Pratet et al. 2004, Klein et Rivera 2004), a v neposlední řadě při analýze potravin, konkrétně piva a jeho surovin (např. Čulík et al. 2009).

V souvislosti se zvyšujícími se nároky na vysokou průchodnost vzorku laboratoří (jinými slovy počtem analýz za časovou jednotku) dochází k neustálému vývoji analytických technik. Také v oblasti HPLC došlo za poslední desetiletí k vývoji směrem k „rychlejším“ analýzám. Existují v podstatě dva základní přístupy k „rychlé chromatografii“. První vede k vývoji zcela nové generace chromatografických kolon a s tím i spojené instrumentace, operující při maximálních tlacích 100 MPa (15 000 PSI) (Swartz 2005). Pro tuto metodu byl zaveden a přijat název Ultra účinná kapalinová chromatografie (UHPLC). Druhý přístup zachovává klasickou HPLC instrumentaci, která pracuje při tlacích 40 MPa (6000 PSI), čemuž ovšem vyhovují jenom novější typy přístrojů. Zrychlení analýzy je v tomto případě zajištěno použitím speciálních kolon, zejména kolon monolitních a kolon s povrchově porézními částicemi.

2 UHPLC – ULTRA ÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE

Složitý proces chromatografické separace je dán souborem interakcí analytu mezi mobilní fází (rozpouštědlem) a stacionární fází (zjednodušeně náplní kolony). Při průchodu analytu chromatografickou kolonou je analyt unášen mobilní fází, ke které má specifickou afinitu (je v ní rozpustný) a dále interaguje s fází stacionární (přenos hmoty). Kontakt analytu se stacionární fází je zprostředkován „difuzí“. Tu rozlišujeme u chromatografického procesu trojího druhu, difuzi podélnou (pohyb částic analytu v mobilní fázi), vířivou (pohyb částic analytu k povrchu částic stacionární fáze a zpět) a difuzi uvnitř pórů částic v různých směrech (transport hmoty analytu do stacionární fáze a zpět). Matematické vyjádření součtu jednotlivých příspěvků difuze nazýváme jako van Deemterova rovnice

H = a(dp) + b/u + c(dp)²u

která udává vztah mezi výškou teoretického patra H kolony (v převrácené hodnotě účinností kolony) a mezi lineární průtokovou rychlostí u mobilní fáze. Příspěvek a (podélná difuze) je ovlivněn pouze velikostí částic, příspěvek b (vířivá difuze) je nepřímo úměrná lineární průtokové rychlosti u a příspěvek c (difuze uvnitř pórů částic) je přímo úměrný lineární průtokové rychlosti a druhé mocnině velikosti částic stacionární fáze.

Obr. 1 Van Deemterova křivka pro částice o průměru 10, 5, 3 a 1,7 μm

Od 70. let, kdy se v náplňových kolonách používaly částice o průměru 10 μm, došlo k ohromnému pokroku při vývoji technologií pro přípravu stále menších částic, a tudíž ke zlepšování parametrů separace. Na obr. 1 jsou znázorněny van Deemterovy křivky pro čtyři různé velikosti běžně používaných částic 10, 5 a 3 μm a nově 1,7 μm. Z něho vyplývá, že se snižujícím se průměrem částic roste účinnost separace (neboli zmenšuje se výška teoretického patra H). To je dáno skutečností, že při redukci částic zlepšíme převod hmoty, tím potlačíme rozmývání, neboli zvýšíme účinnost. Přitom lze při použití takto malých částic účinnosti dosáhnout při mnohem vyšších průtokových rychlostech, což má za následek rychlejší separaci. Této skutečnosti bylo využito při vývoji zcela nových částic, v angl. Literatuře označovaných jako„sub-2 μm“ (Mellors et Jorgenson 2004), a to dalo impuls ke vzniku nové generace kapalinové chromatografie – Ultra účinné kapalinové chromatografie (UHPLC). Díky této technologii lze zkrátit analýzy až devětkrát, citlivost zlepšit třikrát a dvakrát lze zlepšit rozlišení. Takové zrychlení se projeví nejen v úspoře energie a člověkohodiny, ale také v téměř desetinásobné úspoře organických rozpouštědel, a tedy i v nákladech na jejich bezpečnou likvidaci. Tuto bilanci společně s porovnáním obecného HPLC a UHPLC chromatogramu znázorňuje obr. 2. Je nutno zdůraznit, že kolony naplněné sorbentem s tak malým průměrem částic generují mnohonásobně vyšší zpětný tlak, než běžné chromatografické kolony, proto musel být těmto tlakům uzpůsoben zcela nově celý UHPLC instrument, který je schopen při tak vysokých tlacích (100 MPa, 15000 PSI) pracovat.

Obr. 2 Porovnání HPLC a UHPLC chromatogramu (v tabulce je uveden výčet vylepšených parametrů UHPLC oproti HPLC)

Obr. 3 pro ilustraci znázorňuje, jak malé jsou nové 1,7 μm částice v porovnání s běžnou částicí 5 μm a s průměrem lidského vlasu (60 μm).

Obr. 3 Srovnání velikosti hybridní 1,7 μm částice (C) s velikostí běžné 5 μm částice (A) a průměrem lidského vlasu 60 μm (B)

První informace zahrnující princip UHPLC (Schwartz 2005), jeho spojení s UV a MS detektorem (Plumb et al. 2004), popis nového typu „sub-2 μm“ částic a s tím související chemickou podstatou a technologií výroby nových UPLCTM kolon, byly uveřejněny v roce 2004 (Mellors 2004). Tyto kolony, Acquity UPLC BEH C18 (Waters) s průměrem částic 1,7 μm, jsou založeny na BEH technologii (z angl. bridged ethylene hybrid) (Swartz et Murphy 2005). Mezi silanolové skupiny jsou vloženy hybridní ethylenové můstky (viz obr. 4), které fungují jednak jako endkapingové skupiny a navíc zpevňují celkovou strukturu takto připravené silikagelové fáze. To udává kolonám jak vysokou mechanickou odolnost (max. tlak 15 000 PSI), tak i vysokou odolnost chemickou, a proto můžeme na takovýchto kolonách měřit v širokém rozsahu pH. V alkalické oblasti je to až do pH cca 12, v kyselé oblasti mají tyto kolony stabilitu v závislosti na použitém ligandu, a to v oblasti pH 1-2. Navíc jsou odolné vůči jevu zvanému „krvácení kolony“ (angl. bleeding), neboli vymývání ligandu z nosné fáze. V současné době je již na trhu celá škála UHPLC kolon se všemi obvyklými ligandy, např. BEH C18 a C8 (nerozvětvený alkylový řetězec pro klasickou reverzní chromatografii), BEH Shield RP18 (alkylový řetězec s vloženou polární, karbamátovou skupinou, kombinuje hydrofobní a hydrofilní vlastnosti kolony, vhodná pro polyfenolické látky), BEH Phenyl (fenylový ligand ukotvený na C6 alkylu, vhodné pro látky s benzenovým jádrem), BEH Amidová kolona (amidová skupina, dobře zadržuje látky, které jsou pro reverzní chromatografii již moc polární), BEH HILIC (BEH částice bez ligandu, vhodné pro velmi polární látky), pro eluci využívá vodných fází s malými obsahy organického modifikátoru) a mnoho dalších. Délka těchto kolon je 2, 3, 5, 10 a 15 cm, nejčastěji se používají kolony o délce 5 cm. Průměr kolony pro spojení s UV detektorem je nejčastěji 2,1 mm, pro spojení s MS detektorem 1 mm. Tak jako je tomu u klasické chromatografie, je kolona chráněna předkolonkou a navíc speciálním filtrem, který kolonu chrání před případnými nečistotami z mobilní fáze. Malý průměr částic v koloně klade vysoké nároky jak na přípravu mobilní fáze, kterou je nutno předem filtrovat přes membránový filtr 0,2 μm, tak na přípravu vzorku, který je nutno před dávkováním na kolonu filtrovat nebo centrifugovat.

Obr. 4. Znázornění chemické struktury hybridní BEH částice s hybridními ethylenovými můstky

O skutečnosti, že byl nový princip UHPLC všeobecně přijat mezi analytickou veřejností, svědčí nejen stoupající počet výrobců UHPLC kolon s částicemi 1,5–2 μm (např. Waters – Acquity BEH kolony, Restek – Pinnacle® DB kolony, Grace – Vision HT kolony, Thermo Scientific – Hypersil GOLD, Agilent – Eclipse Plus C18 a StableBond SB-C18, Perkin Elmer – Brownlee Analytical DB C18), ale i počet výrobců UHPLC chromatografů. Kromě firmy Waters (chromatograf Acquity), která danou technologii jako první vyvinula, dodávají dnes na trh chromatografy s podobnými vlastnostmi např. firmy Agilent (1200RRLC, Infinity), ThermoElectron (Acella High Speed), Shimadzu (ProminenceUFLC), Dionex (RSLC UltiMAte 3000), Perkin Elmer (Flexar) a další. V literatuře lze nalézt dvě označení pro ultraúčinnou chromatografii UPLC a UHPLC, která lze považovat za synonyma. Jelikož technologii UPLC uvedla poprvé na trh firma Waters, která si zkratku UPLCTM ochránila jako „trade mark“, obecně se pro tuto technologii, přístroje a kolony dalších výrobců přijalo společné označení UHPLC.

Přednosti UHPLC byly využity i při analýzách piva a pivovarských surovin a řada těchto aplikací je výsledkem vědecké práce kolektivu autorů z VÚPS, a.s. Nejnovější aplikací, publikovanou v mezinárodním vědeckém časopisu v roce 2011, je stanovení ochratoxinu A v pivovarských surovinách, pivu (Běláková et al. 2011) a také ve vínu. Převedením původní metodiky HPLC na UHPLC se redukovala doba analýzy z původních 10 min na 2 min. Stejně je tomu tak i v metodě stanovení kyseliny ferulové v ječmeni a sladu (Běláková et al. 2010), kde byla původní doba analýzy 12 min zkrácena na pouhé 2 min. Stejný kolektiv autorů vyvinul řadu dalších UHPLC metodik, které patří do souboru metod VÚPS, a.s. Jsou to kromě stanovení zmíněné kys. ferulové i ostatní fenolické kyseliny (kumarová apod.), dále stanovení vitaminů E a skupiny B v pivu a pivovarských surovinách, stanovení patulinu v pivu a jeho surovinách, v nealko nápojích i víně, anebo silymarinu v extraktu Ostropestřce.

V dalších číslech časopisu uvedeme podrobnější srovnání HPLC a UHPLC na příkladech stanovení α- a β-hořkých kyselin ve chmelu a chmelových preparátech a stanovení cis/transizomerů iso-α-hořkých kyselin v pivu metodami UHPLC, které byly vyvinuty na VÚPS, a.s.

3 KOLONY S POVRCHOVĚ PORÉZNÍMI ČÁSTICEMI

V případě, že uživatel nemá možnost investovat do nového UHPLC přístroje a nechce si pořizovat nový chromatograf, ale použít HPLC přístroj stávající, má alternativní možnost, jak zrychlit chromatografický proces. V takovém případě může pro separaci použít chromatografické kolony s tzv. „povrchově porézními částicemi“, v angličtině označovaných jako „fused-core silica“ nebo „coreshell particles“. Tyto kolony pracují při běžných tlacích (max asi 6000 PSI), a jsou tedy s většinou HPLC instrumentů kompatibilní. Částice, jak je znázorněno na obr. 5, jsou tvořeny pevným jádrem o průměru asi 1,7 μm a porézní silikagelovou slupkou o hloubce asi 0,5 μm (tyto rozměry se liší ± 0,1 μm podle výrobce), v jejíchž pórech dochází k difuzi analytu a přenosu hmoty. Jelikož celkový průměr částic je 2,7 μm, negenerují tyto částice v koloně tak veliký odpor jako „sub-2 částice“. Přitom je hloubka porézní slupky srovnatelná s průměrem „sub-2 částic“. To se projeví ve srovnatelných separačních vlastnostech neboli ve srovnatelné účinnosti a rozlišení v porovnání s UHPLC. To, že analyt nemusí difundovat díky rigidnímu jádru skrz celou částici, zkrátí jeho dráhu a tedy prodlevu v koloně, což má za následek zrychlení analýzy při zachování parametrů separace.

Obr. 5 Částice s porézní vrstvou tvořená pevným jádrem (1,7 μm) a tenkou porézní vrstvou (0,5 μm)

Od roku 2010 bylo vydáno mnoho prací, které potvrzují, že kolony s povrchově porézními částicemi našly v praxi vysoké uplatnění, a že jsou jejich separační schopnosti téměř srovnatelné se „sub-2 částicemi“ (Abrahim et al. 2010, Tylová et al. 2011). Tyto kolony, např. Halo (Mac-Mod Analytical), Ascentis Express (Sigma-Aldrich), Kinetex (Phenomenex) a nebo Poroshell (Agilent), jsou již dostupné v široké škále běžných ligandů. Příkladem využití v potraviná řské analytice je stanovení chinolonů ve vejcích, metoda byla díky použití kolony Kinetex dvakrát zrychlena (Jiménez et al. 2011). V analytice piva a jeho surovin je první aplikací na koloně Kinetex (2,6 μm) rychlé stanovení iso-alfa-hořkých kyselin a některých redukovaných forem tetrahydroiso-alfa kyselin (Koerner et al. 2011).

4 MONOLITNÍ KOLONY

Dalším a v posledních letech rozšířeným způsobem, jak urychlit chromatografický proces, je použití monolitních kolon. Na rozdíl od konvenčních stacionárních fází, které jsou tvořeny jednotlivými částicemi sorbentu o definované velikosti, monolitické HPLC kolony tvoří jediný kus pórovitého materiálu, který zcela zaplňuje vnitřek separační kolony. Oproti typickým kolonám plněným částicemi, monolity neobsahují mezičásticové prostory, kterými se v kolonách uskutečňuje značná část průtoku. Proto musí mobilní fáze protékat póry monolitu, které jsou mnohem větší, než běžné póry v kolonách plněných částicemi. Monolitické kolony mají dva typy pórů: a) velké póry (makropóry) zajišťují rychlý konvektivní tok mobilní fáze monolitem a významně zrychlují přenos hmoty mezi mobilní a stacionární fází, b) středně velké póry (mesopóry) poskytují monolitu dostatečně veliký povrch, a tím vysokou separační kapacitu. Tato struktura umožňuje provozování monolitů při značně vysokých rychlostech mobilních fází bez přílišného zvýšení tlaku (McCalley 2002) a zároveň bez ztráty separační účinnosti, a to i pro separované makromolekuly (bílkoviny, syntetické polymery) (Švec 2009).

Monolitické kolony se připravují hydrolytickou polymerací tetramethoxysilanu nebo tetraethoxysilanu ve vodném roztoku kyseliny octové v přítomnosti polyethylenglykolu. Technologie výroby umožňuje přípravu monolitů s přesně definovanou strukturou, kdy vznikají výhradně mesopóry a makropóry vhodných a nastavitelných rozměrů. Monolitickou stacionární fázi na bázi silikagelu připravil, popsal a aplikoval např. profesor Tanaka se spoluautory (Minakuchi et al. 1996). Řada těchto kolon je již komerčně dostupných, např. Chromolith (Merck) nebo Onyx™ (Phenomenex v licenci Merck).

Z reálných aplikací a porovnávacích studií monolitických a konvenčních reverzních kolon vyplývá, že si také tyto kolony našly své uplatnění při rychlé chromatografii a u řady uživatelů nacházejí stále větší oblibu (Samanidou et al. 2004, Nováková et al. 2004). Také v analýze potravin se tato technologie začíná uplatňovat, autoři (Tzanavaras et Themelis 2007) uveřejnili metodiku simultánního stanovení kofeinu, theobrominu a theofyllinu v kávě a nealkoholických nápojích. Doba analýzy nepřesáhla 1 min, retenční čas posledně eluujícího kofeinu byl 0,7 min.

5 ZÁVĚR

O tom, že se UHPLC stala v posledním desetiletí oblíbenou a rozšířenou separační technikou, svědčí ohromné množství vydaných publikací. Z těchto prací vyplývá, že UHPLC se využívá jak k separaci malých organických molekul, tak i velkých molekul jako jsou proteiny a peptidy. Publikované výsledky potvrzují avizované výhody UHPLC jako jsou její rychlost, citlivost a dobré rozlišení. Své uplatnění nachází UHPLC také v analýze potravin a začíná též pronikat do oblasti pivovarství a sladovnictví.

Kvasný průmysl
 

Mohlo by Vás zajímat

e-liquids, e-juices and nicotine liquids - Customized solutions for complete analysis

Brožury a specifikace
| N/A | Shimadzu
Instrumentace
GC/MSD, GC/SQ, HPLC
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Shimadzu Food Safety Management Data Book

Příručky
| N/A | Shimadzu
Instrumentace
GC, GC/MSD, GC/SQ, HPLC, LC/MS, GPC, LC-SQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Experience New Benchmarks with Empower Shimadzu’s LC/GC Drivers for Waters™ Empower™

Ostatní
| 2020 | Shimadzu
Instrumentace
Software
Výrobce
Shimadzu, Waters
Zaměření
---
 

Podobné články

Vědecký článek | Potraviny

Nové trendy v kapalinové chromatografii a jejich využití v analýze piva a pivovarských surovin. Část 2. Stanovení cis/trans- izomerů iso-α-hořkých kyselin v pivu metodou ultraúčinné kapalinové chromatografie.

Ultra účinná kapalinová chromatografie (UHPLC), využívající principu separace na porézních částicích menších než 2 μm, byla využita při separaci a stanovení prostorových forem iso-α-hořkých látek v pivu.
Vědecký článek | Potraviny

Nové trendy v kapalinové chromatografii a jejich využití v analýze piva a pivovarských surovin. Část 3. Porovnání HPLC a UHPLC stanovení α- a β-hořkých kyselin

Na reprezentativní skupině 11 vzorků chmele byla porovnána klasická metoda vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) se stále více rozšířenou ultra účinnou kapalinovou chromatografií (UHPLC).
Nové trendy v kapalinové chromatografii a jejich využití v analýze piva a pivovarských surovin. Část 1. Teoretický úvod
St, 23.9.2020
| Originální článek z: Kvasný Průmysl
Článek se zabývá pokroky v kapalinové chromatografii. Výhody UHPLC oproti klasické HPLC jsou až devítinásobné zkrácení doby analýzy, dvojnásobné zlepšení rozlišení a trojnásobné zlepšení citlivosti.

Pixabay/nurfayozagzamov1004: Nové trendy v kapalinové chromatografii a jejich využití v analýze piva a pivovarských surovin. Část 1. Teoretický úvod

V souvislosti se zvyšujícími se nároky na rychlost analýz v analytických laboratořích dochází k neustálému zlepšování instrumentálních technik. Článek se zabývá pokroky v nejrozšířenější separační technice, a to v kapalinové chromatografii. Její zcela nová modifikace, ultra účinná kapalinová chromatografie (UHPLC), využívá principu separace na porézních částicích menších než 2 μm. Výhody UHPLC oproti klasické HPLC jsou až devítinásobné zkrácení doby analýzy, dvojnásobné zlepšení rozlišení a trojnásobné zlepšení citlivosti. To vede nejen k ohromné úspoře času, ale také nákladů na energii a organická rozpouštědla a jejich ekologickou likvidaci. Alternativou k UHPLC technice je použití kolon s povrchově porézními částicemi nebo kolon monolitních. UHPLC již našla své uplatnění také v pivovarské analytice.

1 ÚVOD

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) patří mezi nejvíce rozšířené separační techniky běžně využívané v oblastech, jako jsou farmakologie, toxikologie, klinická analýza, dále v různých vědních oborech (Stroh et al. 2008, Pratet et al. 2004, Klein et Rivera 2004), a v neposlední řadě při analýze potravin, konkrétně piva a jeho surovin (např. Čulík et al. 2009).

V souvislosti se zvyšujícími se nároky na vysokou průchodnost vzorku laboratoří (jinými slovy počtem analýz za časovou jednotku) dochází k neustálému vývoji analytických technik. Také v oblasti HPLC došlo za poslední desetiletí k vývoji směrem k „rychlejším“ analýzám. Existují v podstatě dva základní přístupy k „rychlé chromatografii“. První vede k vývoji zcela nové generace chromatografických kolon a s tím i spojené instrumentace, operující při maximálních tlacích 100 MPa (15 000 PSI) (Swartz 2005). Pro tuto metodu byl zaveden a přijat název Ultra účinná kapalinová chromatografie (UHPLC). Druhý přístup zachovává klasickou HPLC instrumentaci, která pracuje při tlacích 40 MPa (6000 PSI), čemuž ovšem vyhovují jenom novější typy přístrojů. Zrychlení analýzy je v tomto případě zajištěno použitím speciálních kolon, zejména kolon monolitních a kolon s povrchově porézními částicemi.

2 UHPLC – ULTRA ÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE

Složitý proces chromatografické separace je dán souborem interakcí analytu mezi mobilní fází (rozpouštědlem) a stacionární fází (zjednodušeně náplní kolony). Při průchodu analytu chromatografickou kolonou je analyt unášen mobilní fází, ke které má specifickou afinitu (je v ní rozpustný) a dále interaguje s fází stacionární (přenos hmoty). Kontakt analytu se stacionární fází je zprostředkován „difuzí“. Tu rozlišujeme u chromatografického procesu trojího druhu, difuzi podélnou (pohyb částic analytu v mobilní fázi), vířivou (pohyb částic analytu k povrchu částic stacionární fáze a zpět) a difuzi uvnitř pórů částic v různých směrech (transport hmoty analytu do stacionární fáze a zpět). Matematické vyjádření součtu jednotlivých příspěvků difuze nazýváme jako van Deemterova rovnice

H = a(dp) + b/u + c(dp)²u

která udává vztah mezi výškou teoretického patra H kolony (v převrácené hodnotě účinností kolony) a mezi lineární průtokovou rychlostí u mobilní fáze. Příspěvek a (podélná difuze) je ovlivněn pouze velikostí částic, příspěvek b (vířivá difuze) je nepřímo úměrná lineární průtokové rychlosti u a příspěvek c (difuze uvnitř pórů částic) je přímo úměrný lineární průtokové rychlosti a druhé mocnině velikosti částic stacionární fáze.

Obr. 1 Van Deemterova křivka pro částice o průměru 10, 5, 3 a 1,7 μm

Od 70. let, kdy se v náplňových kolonách používaly částice o průměru 10 μm, došlo k ohromnému pokroku při vývoji technologií pro přípravu stále menších částic, a tudíž ke zlepšování parametrů separace. Na obr. 1 jsou znázorněny van Deemterovy křivky pro čtyři různé velikosti běžně používaných částic 10, 5 a 3 μm a nově 1,7 μm. Z něho vyplývá, že se snižujícím se průměrem částic roste účinnost separace (neboli zmenšuje se výška teoretického patra H). To je dáno skutečností, že při redukci částic zlepšíme převod hmoty, tím potlačíme rozmývání, neboli zvýšíme účinnost. Přitom lze při použití takto malých částic účinnosti dosáhnout při mnohem vyšších průtokových rychlostech, což má za následek rychlejší separaci. Této skutečnosti bylo využito při vývoji zcela nových částic, v angl. Literatuře označovaných jako„sub-2 μm“ (Mellors et Jorgenson 2004), a to dalo impuls ke vzniku nové generace kapalinové chromatografie – Ultra účinné kapalinové chromatografie (UHPLC). Díky této technologii lze zkrátit analýzy až devětkrát, citlivost zlepšit třikrát a dvakrát lze zlepšit rozlišení. Takové zrychlení se projeví nejen v úspoře energie a člověkohodiny, ale také v téměř desetinásobné úspoře organických rozpouštědel, a tedy i v nákladech na jejich bezpečnou likvidaci. Tuto bilanci společně s porovnáním obecného HPLC a UHPLC chromatogramu znázorňuje obr. 2. Je nutno zdůraznit, že kolony naplněné sorbentem s tak malým průměrem částic generují mnohonásobně vyšší zpětný tlak, než běžné chromatografické kolony, proto musel být těmto tlakům uzpůsoben zcela nově celý UHPLC instrument, který je schopen při tak vysokých tlacích (100 MPa, 15000 PSI) pracovat.

Obr. 2 Porovnání HPLC a UHPLC chromatogramu (v tabulce je uveden výčet vylepšených parametrů UHPLC oproti HPLC)

Obr. 3 pro ilustraci znázorňuje, jak malé jsou nové 1,7 μm částice v porovnání s běžnou částicí 5 μm a s průměrem lidského vlasu (60 μm).

Obr. 3 Srovnání velikosti hybridní 1,7 μm částice (C) s velikostí běžné 5 μm částice (A) a průměrem lidského vlasu 60 μm (B)

První informace zahrnující princip UHPLC (Schwartz 2005), jeho spojení s UV a MS detektorem (Plumb et al. 2004), popis nového typu „sub-2 μm“ částic a s tím související chemickou podstatou a technologií výroby nových UPLCTM kolon, byly uveřejněny v roce 2004 (Mellors 2004). Tyto kolony, Acquity UPLC BEH C18 (Waters) s průměrem částic 1,7 μm, jsou založeny na BEH technologii (z angl. bridged ethylene hybrid) (Swartz et Murphy 2005). Mezi silanolové skupiny jsou vloženy hybridní ethylenové můstky (viz obr. 4), které fungují jednak jako endkapingové skupiny a navíc zpevňují celkovou strukturu takto připravené silikagelové fáze. To udává kolonám jak vysokou mechanickou odolnost (max. tlak 15 000 PSI), tak i vysokou odolnost chemickou, a proto můžeme na takovýchto kolonách měřit v širokém rozsahu pH. V alkalické oblasti je to až do pH cca 12, v kyselé oblasti mají tyto kolony stabilitu v závislosti na použitém ligandu, a to v oblasti pH 1-2. Navíc jsou odolné vůči jevu zvanému „krvácení kolony“ (angl. bleeding), neboli vymývání ligandu z nosné fáze. V současné době je již na trhu celá škála UHPLC kolon se všemi obvyklými ligandy, např. BEH C18 a C8 (nerozvětvený alkylový řetězec pro klasickou reverzní chromatografii), BEH Shield RP18 (alkylový řetězec s vloženou polární, karbamátovou skupinou, kombinuje hydrofobní a hydrofilní vlastnosti kolony, vhodná pro polyfenolické látky), BEH Phenyl (fenylový ligand ukotvený na C6 alkylu, vhodné pro látky s benzenovým jádrem), BEH Amidová kolona (amidová skupina, dobře zadržuje látky, které jsou pro reverzní chromatografii již moc polární), BEH HILIC (BEH částice bez ligandu, vhodné pro velmi polární látky), pro eluci využívá vodných fází s malými obsahy organického modifikátoru) a mnoho dalších. Délka těchto kolon je 2, 3, 5, 10 a 15 cm, nejčastěji se používají kolony o délce 5 cm. Průměr kolony pro spojení s UV detektorem je nejčastěji 2,1 mm, pro spojení s MS detektorem 1 mm. Tak jako je tomu u klasické chromatografie, je kolona chráněna předkolonkou a navíc speciálním filtrem, který kolonu chrání před případnými nečistotami z mobilní fáze. Malý průměr částic v koloně klade vysoké nároky jak na přípravu mobilní fáze, kterou je nutno předem filtrovat přes membránový filtr 0,2 μm, tak na přípravu vzorku, který je nutno před dávkováním na kolonu filtrovat nebo centrifugovat.

Obr. 4. Znázornění chemické struktury hybridní BEH částice s hybridními ethylenovými můstky

O skutečnosti, že byl nový princip UHPLC všeobecně přijat mezi analytickou veřejností, svědčí nejen stoupající počet výrobců UHPLC kolon s částicemi 1,5–2 μm (např. Waters – Acquity BEH kolony, Restek – Pinnacle® DB kolony, Grace – Vision HT kolony, Thermo Scientific – Hypersil GOLD, Agilent – Eclipse Plus C18 a StableBond SB-C18, Perkin Elmer – Brownlee Analytical DB C18), ale i počet výrobců UHPLC chromatografů. Kromě firmy Waters (chromatograf Acquity), která danou technologii jako první vyvinula, dodávají dnes na trh chromatografy s podobnými vlastnostmi např. firmy Agilent (1200RRLC, Infinity), ThermoElectron (Acella High Speed), Shimadzu (ProminenceUFLC), Dionex (RSLC UltiMAte 3000), Perkin Elmer (Flexar) a další. V literatuře lze nalézt dvě označení pro ultraúčinnou chromatografii UPLC a UHPLC, která lze považovat za synonyma. Jelikož technologii UPLC uvedla poprvé na trh firma Waters, která si zkratku UPLCTM ochránila jako „trade mark“, obecně se pro tuto technologii, přístroje a kolony dalších výrobců přijalo společné označení UHPLC.

Přednosti UHPLC byly využity i při analýzách piva a pivovarských surovin a řada těchto aplikací je výsledkem vědecké práce kolektivu autorů z VÚPS, a.s. Nejnovější aplikací, publikovanou v mezinárodním vědeckém časopisu v roce 2011, je stanovení ochratoxinu A v pivovarských surovinách, pivu (Běláková et al. 2011) a také ve vínu. Převedením původní metodiky HPLC na UHPLC se redukovala doba analýzy z původních 10 min na 2 min. Stejně je tomu tak i v metodě stanovení kyseliny ferulové v ječmeni a sladu (Běláková et al. 2010), kde byla původní doba analýzy 12 min zkrácena na pouhé 2 min. Stejný kolektiv autorů vyvinul řadu dalších UHPLC metodik, které patří do souboru metod VÚPS, a.s. Jsou to kromě stanovení zmíněné kys. ferulové i ostatní fenolické kyseliny (kumarová apod.), dále stanovení vitaminů E a skupiny B v pivu a pivovarských surovinách, stanovení patulinu v pivu a jeho surovinách, v nealko nápojích i víně, anebo silymarinu v extraktu Ostropestřce.

V dalších číslech časopisu uvedeme podrobnější srovnání HPLC a UHPLC na příkladech stanovení α- a β-hořkých kyselin ve chmelu a chmelových preparátech a stanovení cis/transizomerů iso-α-hořkých kyselin v pivu metodami UHPLC, které byly vyvinuty na VÚPS, a.s.

3 KOLONY S POVRCHOVĚ PORÉZNÍMI ČÁSTICEMI

V případě, že uživatel nemá možnost investovat do nového UHPLC přístroje a nechce si pořizovat nový chromatograf, ale použít HPLC přístroj stávající, má alternativní možnost, jak zrychlit chromatografický proces. V takovém případě může pro separaci použít chromatografické kolony s tzv. „povrchově porézními částicemi“, v angličtině označovaných jako „fused-core silica“ nebo „coreshell particles“. Tyto kolony pracují při běžných tlacích (max asi 6000 PSI), a jsou tedy s většinou HPLC instrumentů kompatibilní. Částice, jak je znázorněno na obr. 5, jsou tvořeny pevným jádrem o průměru asi 1,7 μm a porézní silikagelovou slupkou o hloubce asi 0,5 μm (tyto rozměry se liší ± 0,1 μm podle výrobce), v jejíchž pórech dochází k difuzi analytu a přenosu hmoty. Jelikož celkový průměr částic je 2,7 μm, negenerují tyto částice v koloně tak veliký odpor jako „sub-2 částice“. Přitom je hloubka porézní slupky srovnatelná s průměrem „sub-2 částic“. To se projeví ve srovnatelných separačních vlastnostech neboli ve srovnatelné účinnosti a rozlišení v porovnání s UHPLC. To, že analyt nemusí difundovat díky rigidnímu jádru skrz celou částici, zkrátí jeho dráhu a tedy prodlevu v koloně, což má za následek zrychlení analýzy při zachování parametrů separace.

Obr. 5 Částice s porézní vrstvou tvořená pevným jádrem (1,7 μm) a tenkou porézní vrstvou (0,5 μm)

Od roku 2010 bylo vydáno mnoho prací, které potvrzují, že kolony s povrchově porézními částicemi našly v praxi vysoké uplatnění, a že jsou jejich separační schopnosti téměř srovnatelné se „sub-2 částicemi“ (Abrahim et al. 2010, Tylová et al. 2011). Tyto kolony, např. Halo (Mac-Mod Analytical), Ascentis Express (Sigma-Aldrich), Kinetex (Phenomenex) a nebo Poroshell (Agilent), jsou již dostupné v široké škále běžných ligandů. Příkladem využití v potraviná řské analytice je stanovení chinolonů ve vejcích, metoda byla díky použití kolony Kinetex dvakrát zrychlena (Jiménez et al. 2011). V analytice piva a jeho surovin je první aplikací na koloně Kinetex (2,6 μm) rychlé stanovení iso-alfa-hořkých kyselin a některých redukovaných forem tetrahydroiso-alfa kyselin (Koerner et al. 2011).

4 MONOLITNÍ KOLONY

Dalším a v posledních letech rozšířeným způsobem, jak urychlit chromatografický proces, je použití monolitních kolon. Na rozdíl od konvenčních stacionárních fází, které jsou tvořeny jednotlivými částicemi sorbentu o definované velikosti, monolitické HPLC kolony tvoří jediný kus pórovitého materiálu, který zcela zaplňuje vnitřek separační kolony. Oproti typickým kolonám plněným částicemi, monolity neobsahují mezičásticové prostory, kterými se v kolonách uskutečňuje značná část průtoku. Proto musí mobilní fáze protékat póry monolitu, které jsou mnohem větší, než běžné póry v kolonách plněných částicemi. Monolitické kolony mají dva typy pórů: a) velké póry (makropóry) zajišťují rychlý konvektivní tok mobilní fáze monolitem a významně zrychlují přenos hmoty mezi mobilní a stacionární fází, b) středně velké póry (mesopóry) poskytují monolitu dostatečně veliký povrch, a tím vysokou separační kapacitu. Tato struktura umožňuje provozování monolitů při značně vysokých rychlostech mobilních fází bez přílišného zvýšení tlaku (McCalley 2002) a zároveň bez ztráty separační účinnosti, a to i pro separované makromolekuly (bílkoviny, syntetické polymery) (Švec 2009).

Monolitické kolony se připravují hydrolytickou polymerací tetramethoxysilanu nebo tetraethoxysilanu ve vodném roztoku kyseliny octové v přítomnosti polyethylenglykolu. Technologie výroby umožňuje přípravu monolitů s přesně definovanou strukturou, kdy vznikají výhradně mesopóry a makropóry vhodných a nastavitelných rozměrů. Monolitickou stacionární fázi na bázi silikagelu připravil, popsal a aplikoval např. profesor Tanaka se spoluautory (Minakuchi et al. 1996). Řada těchto kolon je již komerčně dostupných, např. Chromolith (Merck) nebo Onyx™ (Phenomenex v licenci Merck).

Z reálných aplikací a porovnávacích studií monolitických a konvenčních reverzních kolon vyplývá, že si také tyto kolony našly své uplatnění při rychlé chromatografii a u řady uživatelů nacházejí stále větší oblibu (Samanidou et al. 2004, Nováková et al. 2004). Také v analýze potravin se tato technologie začíná uplatňovat, autoři (Tzanavaras et Themelis 2007) uveřejnili metodiku simultánního stanovení kofeinu, theobrominu a theofyllinu v kávě a nealkoholických nápojích. Doba analýzy nepřesáhla 1 min, retenční čas posledně eluujícího kofeinu byl 0,7 min.

5 ZÁVĚR

O tom, že se UHPLC stala v posledním desetiletí oblíbenou a rozšířenou separační technikou, svědčí ohromné množství vydaných publikací. Z těchto prací vyplývá, že UHPLC se využívá jak k separaci malých organických molekul, tak i velkých molekul jako jsou proteiny a peptidy. Publikované výsledky potvrzují avizované výhody UHPLC jako jsou její rychlost, citlivost a dobré rozlišení. Své uplatnění nachází UHPLC také v analýze potravin a začíná též pronikat do oblasti pivovarství a sladovnictví.

Kvasný průmysl
 

Mohlo by Vás zajímat

e-liquids, e-juices and nicotine liquids - Customized solutions for complete analysis

Brožury a specifikace
| N/A | Shimadzu
Instrumentace
GC/MSD, GC/SQ, HPLC
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Shimadzu Food Safety Management Data Book

Příručky
| N/A | Shimadzu
Instrumentace
GC, GC/MSD, GC/SQ, HPLC, LC/MS, GPC, LC-SQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Experience New Benchmarks with Empower Shimadzu’s LC/GC Drivers for Waters™ Empower™

Ostatní
| 2020 | Shimadzu
Instrumentace
Software
Výrobce
Shimadzu, Waters
Zaměření
---
 

Podobné články

Vědecký článek | Potraviny

Nové trendy v kapalinové chromatografii a jejich využití v analýze piva a pivovarských surovin. Část 2. Stanovení cis/trans- izomerů iso-α-hořkých kyselin v pivu metodou ultraúčinné kapalinové chromatografie.

Ultra účinná kapalinová chromatografie (UHPLC), využívající principu separace na porézních částicích menších než 2 μm, byla využita při separaci a stanovení prostorových forem iso-α-hořkých látek v pivu.
Vědecký článek | Potraviny

Nové trendy v kapalinové chromatografii a jejich využití v analýze piva a pivovarských surovin. Část 3. Porovnání HPLC a UHPLC stanovení α- a β-hořkých kyselin

Na reprezentativní skupině 11 vzorků chmele byla porovnána klasická metoda vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) se stále více rozšířenou ultra účinnou kapalinovou chromatografií (UHPLC).
Nové trendy v kapalinové chromatografii a jejich využití v analýze piva a pivovarských surovin. Část 1. Teoretický úvod
St, 23.9.2020
| Originální článek z: Kvasný Průmysl
Článek se zabývá pokroky v kapalinové chromatografii. Výhody UHPLC oproti klasické HPLC jsou až devítinásobné zkrácení doby analýzy, dvojnásobné zlepšení rozlišení a trojnásobné zlepšení citlivosti.

Pixabay/nurfayozagzamov1004: Nové trendy v kapalinové chromatografii a jejich využití v analýze piva a pivovarských surovin. Část 1. Teoretický úvod

V souvislosti se zvyšujícími se nároky na rychlost analýz v analytických laboratořích dochází k neustálému zlepšování instrumentálních technik. Článek se zabývá pokroky v nejrozšířenější separační technice, a to v kapalinové chromatografii. Její zcela nová modifikace, ultra účinná kapalinová chromatografie (UHPLC), využívá principu separace na porézních částicích menších než 2 μm. Výhody UHPLC oproti klasické HPLC jsou až devítinásobné zkrácení doby analýzy, dvojnásobné zlepšení rozlišení a trojnásobné zlepšení citlivosti. To vede nejen k ohromné úspoře času, ale také nákladů na energii a organická rozpouštědla a jejich ekologickou likvidaci. Alternativou k UHPLC technice je použití kolon s povrchově porézními částicemi nebo kolon monolitních. UHPLC již našla své uplatnění také v pivovarské analytice.

1 ÚVOD

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) patří mezi nejvíce rozšířené separační techniky běžně využívané v oblastech, jako jsou farmakologie, toxikologie, klinická analýza, dále v různých vědních oborech (Stroh et al. 2008, Pratet et al. 2004, Klein et Rivera 2004), a v neposlední řadě při analýze potravin, konkrétně piva a jeho surovin (např. Čulík et al. 2009).

V souvislosti se zvyšujícími se nároky na vysokou průchodnost vzorku laboratoří (jinými slovy počtem analýz za časovou jednotku) dochází k neustálému vývoji analytických technik. Také v oblasti HPLC došlo za poslední desetiletí k vývoji směrem k „rychlejším“ analýzám. Existují v podstatě dva základní přístupy k „rychlé chromatografii“. První vede k vývoji zcela nové generace chromatografických kolon a s tím i spojené instrumentace, operující při maximálních tlacích 100 MPa (15 000 PSI) (Swartz 2005). Pro tuto metodu byl zaveden a přijat název Ultra účinná kapalinová chromatografie (UHPLC). Druhý přístup zachovává klasickou HPLC instrumentaci, která pracuje při tlacích 40 MPa (6000 PSI), čemuž ovšem vyhovují jenom novější typy přístrojů. Zrychlení analýzy je v tomto případě zajištěno použitím speciálních kolon, zejména kolon monolitních a kolon s povrchově porézními částicemi.

2 UHPLC – ULTRA ÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE

Složitý proces chromatografické separace je dán souborem interakcí analytu mezi mobilní fází (rozpouštědlem) a stacionární fází (zjednodušeně náplní kolony). Při průchodu analytu chromatografickou kolonou je analyt unášen mobilní fází, ke které má specifickou afinitu (je v ní rozpustný) a dále interaguje s fází stacionární (přenos hmoty). Kontakt analytu se stacionární fází je zprostředkován „difuzí“. Tu rozlišujeme u chromatografického procesu trojího druhu, difuzi podélnou (pohyb částic analytu v mobilní fázi), vířivou (pohyb částic analytu k povrchu částic stacionární fáze a zpět) a difuzi uvnitř pórů částic v různých směrech (transport hmoty analytu do stacionární fáze a zpět). Matematické vyjádření součtu jednotlivých příspěvků difuze nazýváme jako van Deemterova rovnice

H = a(dp) + b/u + c(dp)²u

která udává vztah mezi výškou teoretického patra H kolony (v převrácené hodnotě účinností kolony) a mezi lineární průtokovou rychlostí u mobilní fáze. Příspěvek a (podélná difuze) je ovlivněn pouze velikostí částic, příspěvek b (vířivá difuze) je nepřímo úměrná lineární průtokové rychlosti u a příspěvek c (difuze uvnitř pórů částic) je přímo úměrný lineární průtokové rychlosti a druhé mocnině velikosti částic stacionární fáze.

Obr. 1 Van Deemterova křivka pro částice o průměru 10, 5, 3 a 1,7 μm

Od 70. let, kdy se v náplňových kolonách používaly částice o průměru 10 μm, došlo k ohromnému pokroku při vývoji technologií pro přípravu stále menších částic, a tudíž ke zlepšování parametrů separace. Na obr. 1 jsou znázorněny van Deemterovy křivky pro čtyři různé velikosti běžně používaných částic 10, 5 a 3 μm a nově 1,7 μm. Z něho vyplývá, že se snižujícím se průměrem částic roste účinnost separace (neboli zmenšuje se výška teoretického patra H). To je dáno skutečností, že při redukci částic zlepšíme převod hmoty, tím potlačíme rozmývání, neboli zvýšíme účinnost. Přitom lze při použití takto malých částic účinnosti dosáhnout při mnohem vyšších průtokových rychlostech, což má za následek rychlejší separaci. Této skutečnosti bylo využito při vývoji zcela nových částic, v angl. Literatuře označovaných jako„sub-2 μm“ (Mellors et Jorgenson 2004), a to dalo impuls ke vzniku nové generace kapalinové chromatografie – Ultra účinné kapalinové chromatografie (UHPLC). Díky této technologii lze zkrátit analýzy až devětkrát, citlivost zlepšit třikrát a dvakrát lze zlepšit rozlišení. Takové zrychlení se projeví nejen v úspoře energie a člověkohodiny, ale také v téměř desetinásobné úspoře organických rozpouštědel, a tedy i v nákladech na jejich bezpečnou likvidaci. Tuto bilanci společně s porovnáním obecného HPLC a UHPLC chromatogramu znázorňuje obr. 2. Je nutno zdůraznit, že kolony naplněné sorbentem s tak malým průměrem částic generují mnohonásobně vyšší zpětný tlak, než běžné chromatografické kolony, proto musel být těmto tlakům uzpůsoben zcela nově celý UHPLC instrument, který je schopen při tak vysokých tlacích (100 MPa, 15000 PSI) pracovat.

Obr. 2 Porovnání HPLC a UHPLC chromatogramu (v tabulce je uveden výčet vylepšených parametrů UHPLC oproti HPLC)

Obr. 3 pro ilustraci znázorňuje, jak malé jsou nové 1,7 μm částice v porovnání s běžnou částicí 5 μm a s průměrem lidského vlasu (60 μm).

Obr. 3 Srovnání velikosti hybridní 1,7 μm částice (C) s velikostí běžné 5 μm částice (A) a průměrem lidského vlasu 60 μm (B)

První informace zahrnující princip UHPLC (Schwartz 2005), jeho spojení s UV a MS detektorem (Plumb et al. 2004), popis nového typu „sub-2 μm“ částic a s tím související chemickou podstatou a technologií výroby nových UPLCTM kolon, byly uveřejněny v roce 2004 (Mellors 2004). Tyto kolony, Acquity UPLC BEH C18 (Waters) s průměrem částic 1,7 μm, jsou založeny na BEH technologii (z angl. bridged ethylene hybrid) (Swartz et Murphy 2005). Mezi silanolové skupiny jsou vloženy hybridní ethylenové můstky (viz obr. 4), které fungují jednak jako endkapingové skupiny a navíc zpevňují celkovou strukturu takto připravené silikagelové fáze. To udává kolonám jak vysokou mechanickou odolnost (max. tlak 15 000 PSI), tak i vysokou odolnost chemickou, a proto můžeme na takovýchto kolonách měřit v širokém rozsahu pH. V alkalické oblasti je to až do pH cca 12, v kyselé oblasti mají tyto kolony stabilitu v závislosti na použitém ligandu, a to v oblasti pH 1-2. Navíc jsou odolné vůči jevu zvanému „krvácení kolony“ (angl. bleeding), neboli vymývání ligandu z nosné fáze. V současné době je již na trhu celá škála UHPLC kolon se všemi obvyklými ligandy, např. BEH C18 a C8 (nerozvětvený alkylový řetězec pro klasickou reverzní chromatografii), BEH Shield RP18 (alkylový řetězec s vloženou polární, karbamátovou skupinou, kombinuje hydrofobní a hydrofilní vlastnosti kolony, vhodná pro polyfenolické látky), BEH Phenyl (fenylový ligand ukotvený na C6 alkylu, vhodné pro látky s benzenovým jádrem), BEH Amidová kolona (amidová skupina, dobře zadržuje látky, které jsou pro reverzní chromatografii již moc polární), BEH HILIC (BEH částice bez ligandu, vhodné pro velmi polární látky), pro eluci využívá vodných fází s malými obsahy organického modifikátoru) a mnoho dalších. Délka těchto kolon je 2, 3, 5, 10 a 15 cm, nejčastěji se používají kolony o délce 5 cm. Průměr kolony pro spojení s UV detektorem je nejčastěji 2,1 mm, pro spojení s MS detektorem 1 mm. Tak jako je tomu u klasické chromatografie, je kolona chráněna předkolonkou a navíc speciálním filtrem, který kolonu chrání před případnými nečistotami z mobilní fáze. Malý průměr částic v koloně klade vysoké nároky jak na přípravu mobilní fáze, kterou je nutno předem filtrovat přes membránový filtr 0,2 μm, tak na přípravu vzorku, který je nutno před dávkováním na kolonu filtrovat nebo centrifugovat.

Obr. 4. Znázornění chemické struktury hybridní BEH částice s hybridními ethylenovými můstky

O skutečnosti, že byl nový princip UHPLC všeobecně přijat mezi analytickou veřejností, svědčí nejen stoupající počet výrobců UHPLC kolon s částicemi 1,5–2 μm (např. Waters – Acquity BEH kolony, Restek – Pinnacle® DB kolony, Grace – Vision HT kolony, Thermo Scientific – Hypersil GOLD, Agilent – Eclipse Plus C18 a StableBond SB-C18, Perkin Elmer – Brownlee Analytical DB C18), ale i počet výrobců UHPLC chromatografů. Kromě firmy Waters (chromatograf Acquity), která danou technologii jako první vyvinula, dodávají dnes na trh chromatografy s podobnými vlastnostmi např. firmy Agilent (1200RRLC, Infinity), ThermoElectron (Acella High Speed), Shimadzu (ProminenceUFLC), Dionex (RSLC UltiMAte 3000), Perkin Elmer (Flexar) a další. V literatuře lze nalézt dvě označení pro ultraúčinnou chromatografii UPLC a UHPLC, která lze považovat za synonyma. Jelikož technologii UPLC uvedla poprvé na trh firma Waters, která si zkratku UPLCTM ochránila jako „trade mark“, obecně se pro tuto technologii, přístroje a kolony dalších výrobců přijalo společné označení UHPLC.

Přednosti UHPLC byly využity i při analýzách piva a pivovarských surovin a řada těchto aplikací je výsledkem vědecké práce kolektivu autorů z VÚPS, a.s. Nejnovější aplikací, publikovanou v mezinárodním vědeckém časopisu v roce 2011, je stanovení ochratoxinu A v pivovarských surovinách, pivu (Běláková et al. 2011) a také ve vínu. Převedením původní metodiky HPLC na UHPLC se redukovala doba analýzy z původních 10 min na 2 min. Stejně je tomu tak i v metodě stanovení kyseliny ferulové v ječmeni a sladu (Běláková et al. 2010), kde byla původní doba analýzy 12 min zkrácena na pouhé 2 min. Stejný kolektiv autorů vyvinul řadu dalších UHPLC metodik, které patří do souboru metod VÚPS, a.s. Jsou to kromě stanovení zmíněné kys. ferulové i ostatní fenolické kyseliny (kumarová apod.), dále stanovení vitaminů E a skupiny B v pivu a pivovarských surovinách, stanovení patulinu v pivu a jeho surovinách, v nealko nápojích i víně, anebo silymarinu v extraktu Ostropestřce.

V dalších číslech časopisu uvedeme podrobnější srovnání HPLC a UHPLC na příkladech stanovení α- a β-hořkých kyselin ve chmelu a chmelových preparátech a stanovení cis/transizomerů iso-α-hořkých kyselin v pivu metodami UHPLC, které byly vyvinuty na VÚPS, a.s.

3 KOLONY S POVRCHOVĚ PORÉZNÍMI ČÁSTICEMI

V případě, že uživatel nemá možnost investovat do nového UHPLC přístroje a nechce si pořizovat nový chromatograf, ale použít HPLC přístroj stávající, má alternativní možnost, jak zrychlit chromatografický proces. V takovém případě může pro separaci použít chromatografické kolony s tzv. „povrchově porézními částicemi“, v angličtině označovaných jako „fused-core silica“ nebo „coreshell particles“. Tyto kolony pracují při běžných tlacích (max asi 6000 PSI), a jsou tedy s většinou HPLC instrumentů kompatibilní. Částice, jak je znázorněno na obr. 5, jsou tvořeny pevným jádrem o průměru asi 1,7 μm a porézní silikagelovou slupkou o hloubce asi 0,5 μm (tyto rozměry se liší ± 0,1 μm podle výrobce), v jejíchž pórech dochází k difuzi analytu a přenosu hmoty. Jelikož celkový průměr částic je 2,7 μm, negenerují tyto částice v koloně tak veliký odpor jako „sub-2 částice“. Přitom je hloubka porézní slupky srovnatelná s průměrem „sub-2 částic“. To se projeví ve srovnatelných separačních vlastnostech neboli ve srovnatelné účinnosti a rozlišení v porovnání s UHPLC. To, že analyt nemusí difundovat díky rigidnímu jádru skrz celou částici, zkrátí jeho dráhu a tedy prodlevu v koloně, což má za následek zrychlení analýzy při zachování parametrů separace.

Obr. 5 Částice s porézní vrstvou tvořená pevným jádrem (1,7 μm) a tenkou porézní vrstvou (0,5 μm)

Od roku 2010 bylo vydáno mnoho prací, které potvrzují, že kolony s povrchově porézními částicemi našly v praxi vysoké uplatnění, a že jsou jejich separační schopnosti téměř srovnatelné se „sub-2 částicemi“ (Abrahim et al. 2010, Tylová et al. 2011). Tyto kolony, např. Halo (Mac-Mod Analytical), Ascentis Express (Sigma-Aldrich), Kinetex (Phenomenex) a nebo Poroshell (Agilent), jsou již dostupné v široké škále běžných ligandů. Příkladem využití v potraviná řské analytice je stanovení chinolonů ve vejcích, metoda byla díky použití kolony Kinetex dvakrát zrychlena (Jiménez et al. 2011). V analytice piva a jeho surovin je první aplikací na koloně Kinetex (2,6 μm) rychlé stanovení iso-alfa-hořkých kyselin a některých redukovaných forem tetrahydroiso-alfa kyselin (Koerner et al. 2011).

4 MONOLITNÍ KOLONY

Dalším a v posledních letech rozšířeným způsobem, jak urychlit chromatografický proces, je použití monolitních kolon. Na rozdíl od konvenčních stacionárních fází, které jsou tvořeny jednotlivými částicemi sorbentu o definované velikosti, monolitické HPLC kolony tvoří jediný kus pórovitého materiálu, který zcela zaplňuje vnitřek separační kolony. Oproti typickým kolonám plněným částicemi, monolity neobsahují mezičásticové prostory, kterými se v kolonách uskutečňuje značná část průtoku. Proto musí mobilní fáze protékat póry monolitu, které jsou mnohem větší, než běžné póry v kolonách plněných částicemi. Monolitické kolony mají dva typy pórů: a) velké póry (makropóry) zajišťují rychlý konvektivní tok mobilní fáze monolitem a významně zrychlují přenos hmoty mezi mobilní a stacionární fází, b) středně velké póry (mesopóry) poskytují monolitu dostatečně veliký povrch, a tím vysokou separační kapacitu. Tato struktura umožňuje provozování monolitů při značně vysokých rychlostech mobilních fází bez přílišného zvýšení tlaku (McCalley 2002) a zároveň bez ztráty separační účinnosti, a to i pro separované makromolekuly (bílkoviny, syntetické polymery) (Švec 2009).

Monolitické kolony se připravují hydrolytickou polymerací tetramethoxysilanu nebo tetraethoxysilanu ve vodném roztoku kyseliny octové v přítomnosti polyethylenglykolu. Technologie výroby umožňuje přípravu monolitů s přesně definovanou strukturou, kdy vznikají výhradně mesopóry a makropóry vhodných a nastavitelných rozměrů. Monolitickou stacionární fázi na bázi silikagelu připravil, popsal a aplikoval např. profesor Tanaka se spoluautory (Minakuchi et al. 1996). Řada těchto kolon je již komerčně dostupných, např. Chromolith (Merck) nebo Onyx™ (Phenomenex v licenci Merck).

Z reálných aplikací a porovnávacích studií monolitických a konvenčních reverzních kolon vyplývá, že si také tyto kolony našly své uplatnění při rychlé chromatografii a u řady uživatelů nacházejí stále větší oblibu (Samanidou et al. 2004, Nováková et al. 2004). Také v analýze potravin se tato technologie začíná uplatňovat, autoři (Tzanavaras et Themelis 2007) uveřejnili metodiku simultánního stanovení kofeinu, theobrominu a theofyllinu v kávě a nealkoholických nápojích. Doba analýzy nepřesáhla 1 min, retenční čas posledně eluujícího kofeinu byl 0,7 min.

5 ZÁVĚR

O tom, že se UHPLC stala v posledním desetiletí oblíbenou a rozšířenou separační technikou, svědčí ohromné množství vydaných publikací. Z těchto prací vyplývá, že UHPLC se využívá jak k separaci malých organických molekul, tak i velkých molekul jako jsou proteiny a peptidy. Publikované výsledky potvrzují avizované výhody UHPLC jako jsou její rychlost, citlivost a dobré rozlišení. Své uplatnění nachází UHPLC také v analýze potravin a začíná též pronikat do oblasti pivovarství a sladovnictví.

Kvasný průmysl
 

Mohlo by Vás zajímat

e-liquids, e-juices and nicotine liquids - Customized solutions for complete analysis

Brožury a specifikace
| N/A | Shimadzu
Instrumentace
GC/MSD, GC/SQ, HPLC
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Shimadzu Food Safety Management Data Book

Příručky
| N/A | Shimadzu
Instrumentace
GC, GC/MSD, GC/SQ, HPLC, LC/MS, GPC, LC-SQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Experience New Benchmarks with Empower Shimadzu’s LC/GC Drivers for Waters™ Empower™

Ostatní
| 2020 | Shimadzu
Instrumentace
Software
Výrobce
Shimadzu, Waters
Zaměření
---
 

Podobné články

Vědecký článek | Potraviny

Nové trendy v kapalinové chromatografii a jejich využití v analýze piva a pivovarských surovin. Část 2. Stanovení cis/trans- izomerů iso-α-hořkých kyselin v pivu metodou ultraúčinné kapalinové chromatografie.

Ultra účinná kapalinová chromatografie (UHPLC), využívající principu separace na porézních částicích menších než 2 μm, byla využita při separaci a stanovení prostorových forem iso-α-hořkých látek v pivu.
Vědecký článek | Potraviny

Nové trendy v kapalinové chromatografii a jejich využití v analýze piva a pivovarských surovin. Část 3. Porovnání HPLC a UHPLC stanovení α- a β-hořkých kyselin

Na reprezentativní skupině 11 vzorků chmele byla porovnána klasická metoda vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) se stále více rozšířenou ultra účinnou kapalinovou chromatografií (UHPLC).
Nové trendy v kapalinové chromatografii a jejich využití v analýze piva a pivovarských surovin. Část 1. Teoretický úvod
St, 23.9.2020
| Originální článek z: Kvasný Průmysl
Článek se zabývá pokroky v kapalinové chromatografii. Výhody UHPLC oproti klasické HPLC jsou až devítinásobné zkrácení doby analýzy, dvojnásobné zlepšení rozlišení a trojnásobné zlepšení citlivosti.

Pixabay/nurfayozagzamov1004: Nové trendy v kapalinové chromatografii a jejich využití v analýze piva a pivovarských surovin. Část 1. Teoretický úvod

V souvislosti se zvyšujícími se nároky na rychlost analýz v analytických laboratořích dochází k neustálému zlepšování instrumentálních technik. Článek se zabývá pokroky v nejrozšířenější separační technice, a to v kapalinové chromatografii. Její zcela nová modifikace, ultra účinná kapalinová chromatografie (UHPLC), využívá principu separace na porézních částicích menších než 2 μm. Výhody UHPLC oproti klasické HPLC jsou až devítinásobné zkrácení doby analýzy, dvojnásobné zlepšení rozlišení a trojnásobné zlepšení citlivosti. To vede nejen k ohromné úspoře času, ale také nákladů na energii a organická rozpouštědla a jejich ekologickou likvidaci. Alternativou k UHPLC technice je použití kolon s povrchově porézními částicemi nebo kolon monolitních. UHPLC již našla své uplatnění také v pivovarské analytice.

1 ÚVOD

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) patří mezi nejvíce rozšířené separační techniky běžně využívané v oblastech, jako jsou farmakologie, toxikologie, klinická analýza, dále v různých vědních oborech (Stroh et al. 2008, Pratet et al. 2004, Klein et Rivera 2004), a v neposlední řadě při analýze potravin, konkrétně piva a jeho surovin (např. Čulík et al. 2009).

V souvislosti se zvyšujícími se nároky na vysokou průchodnost vzorku laboratoří (jinými slovy počtem analýz za časovou jednotku) dochází k neustálému vývoji analytických technik. Také v oblasti HPLC došlo za poslední desetiletí k vývoji směrem k „rychlejším“ analýzám. Existují v podstatě dva základní přístupy k „rychlé chromatografii“. První vede k vývoji zcela nové generace chromatografických kolon a s tím i spojené instrumentace, operující při maximálních tlacích 100 MPa (15 000 PSI) (Swartz 2005). Pro tuto metodu byl zaveden a přijat název Ultra účinná kapalinová chromatografie (UHPLC). Druhý přístup zachovává klasickou HPLC instrumentaci, která pracuje při tlacích 40 MPa (6000 PSI), čemuž ovšem vyhovují jenom novější typy přístrojů. Zrychlení analýzy je v tomto případě zajištěno použitím speciálních kolon, zejména kolon monolitních a kolon s povrchově porézními částicemi.

2 UHPLC – ULTRA ÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE

Složitý proces chromatografické separace je dán souborem interakcí analytu mezi mobilní fází (rozpouštědlem) a stacionární fází (zjednodušeně náplní kolony). Při průchodu analytu chromatografickou kolonou je analyt unášen mobilní fází, ke které má specifickou afinitu (je v ní rozpustný) a dále interaguje s fází stacionární (přenos hmoty). Kontakt analytu se stacionární fází je zprostředkován „difuzí“. Tu rozlišujeme u chromatografického procesu trojího druhu, difuzi podélnou (pohyb částic analytu v mobilní fázi), vířivou (pohyb částic analytu k povrchu částic stacionární fáze a zpět) a difuzi uvnitř pórů částic v různých směrech (transport hmoty analytu do stacionární fáze a zpět). Matematické vyjádření součtu jednotlivých příspěvků difuze nazýváme jako van Deemterova rovnice

H = a(dp) + b/u + c(dp)²u

která udává vztah mezi výškou teoretického patra H kolony (v převrácené hodnotě účinností kolony) a mezi lineární průtokovou rychlostí u mobilní fáze. Příspěvek a (podélná difuze) je ovlivněn pouze velikostí částic, příspěvek b (vířivá difuze) je nepřímo úměrná lineární průtokové rychlosti u a příspěvek c (difuze uvnitř pórů částic) je přímo úměrný lineární průtokové rychlosti a druhé mocnině velikosti částic stacionární fáze.

Obr. 1 Van Deemterova křivka pro částice o průměru 10, 5, 3 a 1,7 μm

Od 70. let, kdy se v náplňových kolonách používaly částice o průměru 10 μm, došlo k ohromnému pokroku při vývoji technologií pro přípravu stále menších částic, a tudíž ke zlepšování parametrů separace. Na obr. 1 jsou znázorněny van Deemterovy křivky pro čtyři různé velikosti běžně používaných částic 10, 5 a 3 μm a nově 1,7 μm. Z něho vyplývá, že se snižujícím se průměrem částic roste účinnost separace (neboli zmenšuje se výška teoretického patra H). To je dáno skutečností, že při redukci částic zlepšíme převod hmoty, tím potlačíme rozmývání, neboli zvýšíme účinnost. Přitom lze při použití takto malých částic účinnosti dosáhnout při mnohem vyšších průtokových rychlostech, což má za následek rychlejší separaci. Této skutečnosti bylo využito při vývoji zcela nových částic, v angl. Literatuře označovaných jako„sub-2 μm“ (Mellors et Jorgenson 2004), a to dalo impuls ke vzniku nové generace kapalinové chromatografie – Ultra účinné kapalinové chromatografie (UHPLC). Díky této technologii lze zkrátit analýzy až devětkrát, citlivost zlepšit třikrát a dvakrát lze zlepšit rozlišení. Takové zrychlení se projeví nejen v úspoře energie a člověkohodiny, ale také v téměř desetinásobné úspoře organických rozpouštědel, a tedy i v nákladech na jejich bezpečnou likvidaci. Tuto bilanci společně s porovnáním obecného HPLC a UHPLC chromatogramu znázorňuje obr. 2. Je nutno zdůraznit, že kolony naplněné sorbentem s tak malým průměrem částic generují mnohonásobně vyšší zpětný tlak, než běžné chromatografické kolony, proto musel být těmto tlakům uzpůsoben zcela nově celý UHPLC instrument, který je schopen při tak vysokých tlacích (100 MPa, 15000 PSI) pracovat.

Obr. 2 Porovnání HPLC a UHPLC chromatogramu (v tabulce je uveden výčet vylepšených parametrů UHPLC oproti HPLC)

Obr. 3 pro ilustraci znázorňuje, jak malé jsou nové 1,7 μm částice v porovnání s běžnou částicí 5 μm a s průměrem lidského vlasu (60 μm).

Obr. 3 Srovnání velikosti hybridní 1,7 μm částice (C) s velikostí běžné 5 μm částice (A) a průměrem lidského vlasu 60 μm (B)

První informace zahrnující princip UHPLC (Schwartz 2005), jeho spojení s UV a MS detektorem (Plumb et al. 2004), popis nového typu „sub-2 μm“ částic a s tím související chemickou podstatou a technologií výroby nových UPLCTM kolon, byly uveřejněny v roce 2004 (Mellors 2004). Tyto kolony, Acquity UPLC BEH C18 (Waters) s průměrem částic 1,7 μm, jsou založeny na BEH technologii (z angl. bridged ethylene hybrid) (Swartz et Murphy 2005). Mezi silanolové skupiny jsou vloženy hybridní ethylenové můstky (viz obr. 4), které fungují jednak jako endkapingové skupiny a navíc zpevňují celkovou strukturu takto připravené silikagelové fáze. To udává kolonám jak vysokou mechanickou odolnost (max. tlak 15 000 PSI), tak i vysokou odolnost chemickou, a proto můžeme na takovýchto kolonách měřit v širokém rozsahu pH. V alkalické oblasti je to až do pH cca 12, v kyselé oblasti mají tyto kolony stabilitu v závislosti na použitém ligandu, a to v oblasti pH 1-2. Navíc jsou odolné vůči jevu zvanému „krvácení kolony“ (angl. bleeding), neboli vymývání ligandu z nosné fáze. V současné době je již na trhu celá škála UHPLC kolon se všemi obvyklými ligandy, např. BEH C18 a C8 (nerozvětvený alkylový řetězec pro klasickou reverzní chromatografii), BEH Shield RP18 (alkylový řetězec s vloženou polární, karbamátovou skupinou, kombinuje hydrofobní a hydrofilní vlastnosti kolony, vhodná pro polyfenolické látky), BEH Phenyl (fenylový ligand ukotvený na C6 alkylu, vhodné pro látky s benzenovým jádrem), BEH Amidová kolona (amidová skupina, dobře zadržuje látky, které jsou pro reverzní chromatografii již moc polární), BEH HILIC (BEH částice bez ligandu, vhodné pro velmi polární látky), pro eluci využívá vodných fází s malými obsahy organického modifikátoru) a mnoho dalších. Délka těchto kolon je 2, 3, 5, 10 a 15 cm, nejčastěji se používají kolony o délce 5 cm. Průměr kolony pro spojení s UV detektorem je nejčastěji 2,1 mm, pro spojení s MS detektorem 1 mm. Tak jako je tomu u klasické chromatografie, je kolona chráněna předkolonkou a navíc speciálním filtrem, který kolonu chrání před případnými nečistotami z mobilní fáze. Malý průměr částic v koloně klade vysoké nároky jak na přípravu mobilní fáze, kterou je nutno předem filtrovat přes membránový filtr 0,2 μm, tak na přípravu vzorku, který je nutno před dávkováním na kolonu filtrovat nebo centrifugovat.

Obr. 4. Znázornění chemické struktury hybridní BEH částice s hybridními ethylenovými můstky

O skutečnosti, že byl nový princip UHPLC všeobecně přijat mezi analytickou veřejností, svědčí nejen stoupající počet výrobců UHPLC kolon s částicemi 1,5–2 μm (např. Waters – Acquity BEH kolony, Restek – Pinnacle® DB kolony, Grace – Vision HT kolony, Thermo Scientific – Hypersil GOLD, Agilent – Eclipse Plus C18 a StableBond SB-C18, Perkin Elmer – Brownlee Analytical DB C18), ale i počet výrobců UHPLC chromatografů. Kromě firmy Waters (chromatograf Acquity), která danou technologii jako první vyvinula, dodávají dnes na trh chromatografy s podobnými vlastnostmi např. firmy Agilent (1200RRLC, Infinity), ThermoElectron (Acella High Speed), Shimadzu (ProminenceUFLC), Dionex (RSLC UltiMAte 3000), Perkin Elmer (Flexar) a další. V literatuře lze nalézt dvě označení pro ultraúčinnou chromatografii UPLC a UHPLC, která lze považovat za synonyma. Jelikož technologii UPLC uvedla poprvé na trh firma Waters, která si zkratku UPLCTM ochránila jako „trade mark“, obecně se pro tuto technologii, přístroje a kolony dalších výrobců přijalo společné označení UHPLC.

Přednosti UHPLC byly využity i při analýzách piva a pivovarských surovin a řada těchto aplikací je výsledkem vědecké práce kolektivu autorů z VÚPS, a.s. Nejnovější aplikací, publikovanou v mezinárodním vědeckém časopisu v roce 2011, je stanovení ochratoxinu A v pivovarských surovinách, pivu (Běláková et al. 2011) a také ve vínu. Převedením původní metodiky HPLC na UHPLC se redukovala doba analýzy z původních 10 min na 2 min. Stejně je tomu tak i v metodě stanovení kyseliny ferulové v ječmeni a sladu (Běláková et al. 2010), kde byla původní doba analýzy 12 min zkrácena na pouhé 2 min. Stejný kolektiv autorů vyvinul řadu dalších UHPLC metodik, které patří do souboru metod VÚPS, a.s. Jsou to kromě stanovení zmíněné kys. ferulové i ostatní fenolické kyseliny (kumarová apod.), dále stanovení vitaminů E a skupiny B v pivu a pivovarských surovinách, stanovení patulinu v pivu a jeho surovinách, v nealko nápojích i víně, anebo silymarinu v extraktu Ostropestřce.

V dalších číslech časopisu uvedeme podrobnější srovnání HPLC a UHPLC na příkladech stanovení α- a β-hořkých kyselin ve chmelu a chmelových preparátech a stanovení cis/transizomerů iso-α-hořkých kyselin v pivu metodami UHPLC, které byly vyvinuty na VÚPS, a.s.

3 KOLONY S POVRCHOVĚ PORÉZNÍMI ČÁSTICEMI

V případě, že uživatel nemá možnost investovat do nového UHPLC přístroje a nechce si pořizovat nový chromatograf, ale použít HPLC přístroj stávající, má alternativní možnost, jak zrychlit chromatografický proces. V takovém případě může pro separaci použít chromatografické kolony s tzv. „povrchově porézními částicemi“, v angličtině označovaných jako „fused-core silica“ nebo „coreshell particles“. Tyto kolony pracují při běžných tlacích (max asi 6000 PSI), a jsou tedy s většinou HPLC instrumentů kompatibilní. Částice, jak je znázorněno na obr. 5, jsou tvořeny pevným jádrem o průměru asi 1,7 μm a porézní silikagelovou slupkou o hloubce asi 0,5 μm (tyto rozměry se liší ± 0,1 μm podle výrobce), v jejíchž pórech dochází k difuzi analytu a přenosu hmoty. Jelikož celkový průměr částic je 2,7 μm, negenerují tyto částice v koloně tak veliký odpor jako „sub-2 částice“. Přitom je hloubka porézní slupky srovnatelná s průměrem „sub-2 částic“. To se projeví ve srovnatelných separačních vlastnostech neboli ve srovnatelné účinnosti a rozlišení v porovnání s UHPLC. To, že analyt nemusí difundovat díky rigidnímu jádru skrz celou částici, zkrátí jeho dráhu a tedy prodlevu v koloně, což má za následek zrychlení analýzy při zachování parametrů separace.

Obr. 5 Částice s porézní vrstvou tvořená pevným jádrem (1,7 μm) a tenkou porézní vrstvou (0,5 μm)

Od roku 2010 bylo vydáno mnoho prací, které potvrzují, že kolony s povrchově porézními částicemi našly v praxi vysoké uplatnění, a že jsou jejich separační schopnosti téměř srovnatelné se „sub-2 částicemi“ (Abrahim et al. 2010, Tylová et al. 2011). Tyto kolony, např. Halo (Mac-Mod Analytical), Ascentis Express (Sigma-Aldrich), Kinetex (Phenomenex) a nebo Poroshell (Agilent), jsou již dostupné v široké škále běžných ligandů. Příkladem využití v potraviná řské analytice je stanovení chinolonů ve vejcích, metoda byla díky použití kolony Kinetex dvakrát zrychlena (Jiménez et al. 2011). V analytice piva a jeho surovin je první aplikací na koloně Kinetex (2,6 μm) rychlé stanovení iso-alfa-hořkých kyselin a některých redukovaných forem tetrahydroiso-alfa kyselin (Koerner et al. 2011).

4 MONOLITNÍ KOLONY

Dalším a v posledních letech rozšířeným způsobem, jak urychlit chromatografický proces, je použití monolitních kolon. Na rozdíl od konvenčních stacionárních fází, které jsou tvořeny jednotlivými částicemi sorbentu o definované velikosti, monolitické HPLC kolony tvoří jediný kus pórovitého materiálu, který zcela zaplňuje vnitřek separační kolony. Oproti typickým kolonám plněným částicemi, monolity neobsahují mezičásticové prostory, kterými se v kolonách uskutečňuje značná část průtoku. Proto musí mobilní fáze protékat póry monolitu, které jsou mnohem větší, než běžné póry v kolonách plněných částicemi. Monolitické kolony mají dva typy pórů: a) velké póry (makropóry) zajišťují rychlý konvektivní tok mobilní fáze monolitem a významně zrychlují přenos hmoty mezi mobilní a stacionární fází, b) středně velké póry (mesopóry) poskytují monolitu dostatečně veliký povrch, a tím vysokou separační kapacitu. Tato struktura umožňuje provozování monolitů při značně vysokých rychlostech mobilních fází bez přílišného zvýšení tlaku (McCalley 2002) a zároveň bez ztráty separační účinnosti, a to i pro separované makromolekuly (bílkoviny, syntetické polymery) (Švec 2009).

Monolitické kolony se připravují hydrolytickou polymerací tetramethoxysilanu nebo tetraethoxysilanu ve vodném roztoku kyseliny octové v přítomnosti polyethylenglykolu. Technologie výroby umožňuje přípravu monolitů s přesně definovanou strukturou, kdy vznikají výhradně mesopóry a makropóry vhodných a nastavitelných rozměrů. Monolitickou stacionární fázi na bázi silikagelu připravil, popsal a aplikoval např. profesor Tanaka se spoluautory (Minakuchi et al. 1996). Řada těchto kolon je již komerčně dostupných, např. Chromolith (Merck) nebo Onyx™ (Phenomenex v licenci Merck).

Z reálných aplikací a porovnávacích studií monolitických a konvenčních reverzních kolon vyplývá, že si také tyto kolony našly své uplatnění při rychlé chromatografii a u řady uživatelů nacházejí stále větší oblibu (Samanidou et al. 2004, Nováková et al. 2004). Také v analýze potravin se tato technologie začíná uplatňovat, autoři (Tzanavaras et Themelis 2007) uveřejnili metodiku simultánního stanovení kofeinu, theobrominu a theofyllinu v kávě a nealkoholických nápojích. Doba analýzy nepřesáhla 1 min, retenční čas posledně eluujícího kofeinu byl 0,7 min.

5 ZÁVĚR

O tom, že se UHPLC stala v posledním desetiletí oblíbenou a rozšířenou separační technikou, svědčí ohromné množství vydaných publikací. Z těchto prací vyplývá, že UHPLC se využívá jak k separaci malých organických molekul, tak i velkých molekul jako jsou proteiny a peptidy. Publikované výsledky potvrzují avizované výhody UHPLC jako jsou její rychlost, citlivost a dobré rozlišení. Své uplatnění nachází UHPLC také v analýze potravin a začíná též pronikat do oblasti pivovarství a sladovnictví.

Kvasný průmysl
 

Mohlo by Vás zajímat

e-liquids, e-juices and nicotine liquids - Customized solutions for complete analysis

Brožury a specifikace
| N/A | Shimadzu
Instrumentace
GC/MSD, GC/SQ, HPLC
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Shimadzu Food Safety Management Data Book

Příručky
| N/A | Shimadzu
Instrumentace
GC, GC/MSD, GC/SQ, HPLC, LC/MS, GPC, LC-SQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Experience New Benchmarks with Empower Shimadzu’s LC/GC Drivers for Waters™ Empower™

Ostatní
| 2020 | Shimadzu
Instrumentace
Software
Výrobce
Shimadzu, Waters
Zaměření
---
 

Podobné články

Vědecký článek | Potraviny

Nové trendy v kapalinové chromatografii a jejich využití v analýze piva a pivovarských surovin. Část 2. Stanovení cis/trans- izomerů iso-α-hořkých kyselin v pivu metodou ultraúčinné kapalinové chromatografie.

Ultra účinná kapalinová chromatografie (UHPLC), využívající principu separace na porézních částicích menších než 2 μm, byla využita při separaci a stanovení prostorových forem iso-α-hořkých látek v pivu.
Vědecký článek | Potraviny

Nové trendy v kapalinové chromatografii a jejich využití v analýze piva a pivovarských surovin. Část 3. Porovnání HPLC a UHPLC stanovení α- a β-hořkých kyselin

Na reprezentativní skupině 11 vzorků chmele byla porovnána klasická metoda vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) se stále více rozšířenou ultra účinnou kapalinovou chromatografií (UHPLC).
Další projekty
Sledujte nás
Další informace
WebinářeO násKontaktujte násPodmínky užití

LabRulez s.r.o. Všechna práva vyhrazena.