21. Škola hmotnostní spektrometrie: Orbitální pasti ve vývoji biofarmak

St, 16.9.2020
| Originální článek z: Pragolab/Lukáš Plaček
V přednášce na 21. Škole hmotnostní spektrometrie se zameříme na podporu a implementaci moderních chromatografických a hmotnostně spektrometrických postupů v charakterizaci a kvantifikaci biofarmak a nečistot.
Video placeholder

Pragolab: Orbitální pasti ve vývoji biofarmak

Biofarmaka zaujímají vedle kompletně synteticky připravených látek významnou a stále expandující oblast na poli léčiv. Může se jednat o krev a krevní komponenty, buňky, tkáně, vakcíny či celé živé organismy, ale hlavně monoklonální protilátky (mAb, struktura proteinu) a fúzní proteiny, které na trhu podle serveru Pharmacompass.com dominují. Díky nim se poslední léta biofarmaka umísťují v žebříčcích nejprodávanějších (dle objemu peněz) léčiv na předních příčkách a v loňském roce se jich v prvních deseti umístilo úctyhodných šest (viz Obr. 1). Biologická léčba (tedy taková, kde jsou použita biofarmaka) našla nezastupitelnou roli ve zvyšování kvality života při onkologické a imunologické terapii nejen díky své efektivitě, ale hlavně díky minimalizaci vedlejších účinků.

Obr. 1: nejprodávanější léčiva/účinné látky roku 2019 dle serveru pharmacompass.com

Vakcíny nikdy nepatřily k hlavním tahounům farmaceutického průmyslu, což se však může brzy změnit díky současnému koronavirovému rozšíření (milovníci konspiračních teorií zvedají obočí). Nelze opomenout fakt, že významní potenciální producenti očkovacích agens proti SARS-CoV-2 viru nekonstruují vakcínu na bázi oslabených či mrtvých virů jak je běžně zvykem, ale na základě produkce (in vitro v bioreaktorech nebo in vivo v těle po vakcinaci) tzv. spike proteinů („satelitní struktury“ na povrchu viru, viz Obr. 2), které mají přítomnost koronaviru navodit a nastartovat kýženou imunitní reakci.

Obr. 2: skladba SARS-CoV-2 viru spolu s proteinovými strukturami (N Engl J Med 2020; 382:2261-2264)

V kontextu s výše uvedenými skutečnostmi stojí analytičtí chemici před úkolem, jak zvládnout charakterizaci a následnou kvantifikaci účinných látek a potenciálních nečistot. Specialisté přicházející z prostředí ortodoxních molekulárně biologických technik nastavili a formálně v direktivách ukotvili praktická a v jistých mezích i dostatečná kritéria s pomocí technik jako je ELISA a SDS-PAGE. Jiní specialisté (léta bičovaní regulemi jakosti syntetických molekul), kteří využívají moderní chromatografické postupy s vysoko rozlišující hmotnostní spektrometrií (HRMS) bývají často zaskočeni, udiveni a navrhují nekompromisní zásahy založené na masivním využití platformy HRMS. Vždyť i k biologickým léčivům lze přistupovat v komplexním analytickém pojetí (i nejprodávanější účinnou bio-látku adalimumab lze popsat sumárním vzorcem C6428H9912N1694O1987S46).

První logický krok s HRMS přístupem se nabízí provést chromatografickou separaci na reverzní fázi s následnou hmotnostně spektrometrickou analýzou. Zde platí pravidlo o nastavení co největšího rozlišení na hmotnostním spektrometru (běžně 150 000, nejlépe > 200 000 FWHM), čemuž vyhovují spektrometry s iontovou cyklotronou rezonancí nebo orbitální pastí. Díky cenové dostupnosti, bench-top uspořádání a nízkým provozním nákladům se orbitrapy (viz Obr. 3) stávají první volbou. Krásně vykreslená obálka různých nábojových stavů monoklonální protilátky ve stavu denaturovaném a nativním je znázorněna na Obr 4. Zajímavé zjištění přinese zoom jednoho nábojového klastru, resp. spektrum po dekonvoluci, kde lze elegantně pozorovat glykosylační adukty (lišící se počtem navázaných galaktózových jednotek, tj. s hmotnostním rozdílem 162), produkty posttranslační modifikace při bioprodukci. Detailní studium glykosylace může být provedeno iontově chromatografickou separací po kyselé hydrolýze (analýza monosacharidů)) nebo po glykosidázovém štěpení (analýza glykanů/oligosacharidů) nebo proteomickým bottom-up přístupem.

Obr. 3: hmotnostní spektrum adalimumabu, ESI+, rozlišení 200 000 FWHM, orbitální past

Obr. 4: princip detekce a zpracování signálu na orbitální iontové pasti

Další krok při charakterizaci biofarmak by měl směřovat k ortogonální separaci (proti reverzní fázi) na iontoměniči. Protože monoklonální protilátky a fúzní proteiny mají díky přítomnosti amino- a karboxylových skupin dostatečný náboj v širokém rozmezí pH, očekává se zajímavý profil, neboť na základě poznatků z glykosylačních studií podléhají biofarmaka rozsáhlým posttranslačním modifikacím.

Obr. 5: glykosylační adukty adalimumabu (lišící se počtem navázaných galaktózových jednotek, tj. s hmotnostním rozdílem 162), produkty posttransalční modifikace při bioprodukci

Výsledek je bez zardění překvapující. Díky vazbě až dvou molekul lysinu na C-konce protilátky a procesu vícenásobné deamidace aminokyselin asparaginu a glutaminu v řetězci proteinu dochází k tvorbě (a nikoliv na úrovni stopových množství) k řadě různě nabitých variant oddělitelných jak chromatograficky tak i hmotnostně spektrometricky, viz Obr. 6, 7 a 8.

Obr. 6: chromatografická separace finální monoklonální protilátky na iontoměniči odhalující přítomnost nábojových variant

Obr. 7: chromatografická separace adalimumabu na iontoměniči odhalující přítomnost nábojových variant (deamidace + lysinové modifikanty); HRMS spektrum dokladuje charakterizaci trojnásobného deamidačního produktu, navíc glykosylovaného, na nízké koncentrační úrovni

Obr. 8: profily jednotlivých finálních forem komerčně dostupných biofarmak z pohledu přítomnosti nábojových variant z procesu posttranslační modifikace

Studium dalších a dalších modifikací biofarmak se zdá být bezbřehé. S orbitálními pastmi lze odhalovat oxidace na methioninu a tryptofanu, tvorbu pyroglutamátů nebo např. rozpad disulfidické vazby; významná kapitola odhalování nečistot při bioprocesu je také detekce a následná eliminace proteinů z hostitelské buňky (host cell proteins). Podpora a implementace moderních chromatografických a hmotnostně spektrometrických postupů se stává klíčem k úspěšnému analytickému zvládnutí problematiky charakterizace a kvantifikace biofarmak a příbuzných nečistot.

Škola hmotnostní spektrometrie
 

Mohlo by Vás zajímat

Nitrosamines Analysis with LC/MS-MS

Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Waters
Zaměření
Farmaceutická analýza

Agilent AdvanceBio Amide HILIC 1.8 μm Columns

Instrumentace
Spotřební materiál, LC kolony
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
---

Jak hledat ty správné informace od Shimadzu (Portály LabRulez)

Instrumentace
HPLC, LC/MS
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
---

Pesticidy v chráněných krajinných oblastech

Instrumentace
---
Výrobce
---
Zaměření
Životní prostředí

Urychlete vývoj HPLC metody o 30%

Instrumentace
Spotřební materiál, HPLC, LC kolony
Výrobce
Waters
Zaměření
---
 

Podobné články


Článek | Produkt

Nové nástroje k identifikaci nečistot v oblasti HPLC a LC/HRMS Orbitrap

Odhalení a následná identifikace minoritních nečistot vedle hlavní komponenty, ať už ve vstupních surovinách, mezistupních či finálních produktech, se stala noční můrou mnoha analytiků.

Článek | Produkt

BioHPLC kolony Agilent pro analýzy makromolekulárních látek - část 2

Ve druhé části se podíváme na další BioHPLC kolony pro monitoring a identifikaci kritických proměnných ve farmaceutickém průmyslu biologických léčiv typu IEX, HILIC nebo HIC.

Článek | Produkt

Orbitální pasti ve službách pokroku (23. Škola MS)

Kam směřuje vývoj orbitálních pastí? Kde bude orbitrap za pět, deset let? Zastaví se ohromný rozvoj této techniky, který započal před pár desetiletími, nebo bude dále expandovat?

Článek | Produkt

Orbitrap Astral - hvězdný hmotnostní spektrometr

Nový hmotnostní spektrometr Orbitrap Astral je jeden z nejvýznamnějších pokroků v oblasti hmotnostní spektrometrie za poslední desetiletí.
 

Podobné články


Článek | Produkt

Nové nástroje k identifikaci nečistot v oblasti HPLC a LC/HRMS Orbitrap

Odhalení a následná identifikace minoritních nečistot vedle hlavní komponenty, ať už ve vstupních surovinách, mezistupních či finálních produktech, se stala noční můrou mnoha analytiků.

Článek | Produkt

BioHPLC kolony Agilent pro analýzy makromolekulárních látek - část 2

Ve druhé části se podíváme na další BioHPLC kolony pro monitoring a identifikaci kritických proměnných ve farmaceutickém průmyslu biologických léčiv typu IEX, HILIC nebo HIC.

Článek | Produkt

Orbitální pasti ve službách pokroku (23. Škola MS)

Kam směřuje vývoj orbitálních pastí? Kde bude orbitrap za pět, deset let? Zastaví se ohromný rozvoj této techniky, který započal před pár desetiletími, nebo bude dále expandovat?

Článek | Produkt

Orbitrap Astral - hvězdný hmotnostní spektrometr

Nový hmotnostní spektrometr Orbitrap Astral je jeden z nejvýznamnějších pokroků v oblasti hmotnostní spektrometrie za poslední desetiletí.
 

Podobné články


Článek | Produkt

Nové nástroje k identifikaci nečistot v oblasti HPLC a LC/HRMS Orbitrap

Odhalení a následná identifikace minoritních nečistot vedle hlavní komponenty, ať už ve vstupních surovinách, mezistupních či finálních produktech, se stala noční můrou mnoha analytiků.

Článek | Produkt

BioHPLC kolony Agilent pro analýzy makromolekulárních látek - část 2

Ve druhé části se podíváme na další BioHPLC kolony pro monitoring a identifikaci kritických proměnných ve farmaceutickém průmyslu biologických léčiv typu IEX, HILIC nebo HIC.

Článek | Produkt

Orbitální pasti ve službách pokroku (23. Škola MS)

Kam směřuje vývoj orbitálních pastí? Kde bude orbitrap za pět, deset let? Zastaví se ohromný rozvoj této techniky, který započal před pár desetiletími, nebo bude dále expandovat?

Článek | Produkt

Orbitrap Astral - hvězdný hmotnostní spektrometr

Nový hmotnostní spektrometr Orbitrap Astral je jeden z nejvýznamnějších pokroků v oblasti hmotnostní spektrometrie za poslední desetiletí.
 

Podobné články


Článek | Produkt

Nové nástroje k identifikaci nečistot v oblasti HPLC a LC/HRMS Orbitrap

Odhalení a následná identifikace minoritních nečistot vedle hlavní komponenty, ať už ve vstupních surovinách, mezistupních či finálních produktech, se stala noční můrou mnoha analytiků.

Článek | Produkt

BioHPLC kolony Agilent pro analýzy makromolekulárních látek - část 2

Ve druhé části se podíváme na další BioHPLC kolony pro monitoring a identifikaci kritických proměnných ve farmaceutickém průmyslu biologických léčiv typu IEX, HILIC nebo HIC.

Článek | Produkt

Orbitální pasti ve službách pokroku (23. Škola MS)

Kam směřuje vývoj orbitálních pastí? Kde bude orbitrap za pět, deset let? Zastaví se ohromný rozvoj této techniky, který započal před pár desetiletími, nebo bude dále expandovat?

Článek | Produkt

Orbitrap Astral - hvězdný hmotnostní spektrometr

Nový hmotnostní spektrometr Orbitrap Astral je jeden z nejvýznamnějších pokroků v oblasti hmotnostní spektrometrie za poslední desetiletí.