21. Škola hmotnostní spektrometrie: Orbitální pasti ve vývoji biofarmak

St, 16.9.2020
| Originální článek z: Pragolab/Lukáš Plaček
V přednášce na 21. Škole hmotnostní spektrometrie se zameříme na podporu a implementaci moderních chromatografických a hmotnostně spektrometrických postupů v charakterizaci a kvantifikaci biofarmak a nečistot.

Pragolab: Orbitální pasti ve vývoji biofarmak

Biofarmaka zaujímají vedle kompletně synteticky připravených látek významnou a stále expandující oblast na poli léčiv. Může se jednat o krev a krevní komponenty, buňky, tkáně, vakcíny či celé živé organismy, ale hlavně monoklonální protilátky (mAb, struktura proteinu) a fúzní proteiny, které na trhu podle serveru Pharmacompass.com dominují. Díky nim se poslední léta biofarmaka umísťují v žebříčcích nejprodávanějších (dle objemu peněz) léčiv na předních příčkách a v loňském roce se jich v prvních deseti umístilo úctyhodných šest (viz Obr. 1). Biologická léčba (tedy taková, kde jsou použita biofarmaka) našla nezastupitelnou roli ve zvyšování kvality života při onkologické a imunologické terapii nejen díky své efektivitě, ale hlavně díky minimalizaci vedlejších účinků.

Obr. 1: nejprodávanější léčiva/účinné látky roku 2019 dle serveru pharmacompass.com

Vakcíny nikdy nepatřily k hlavním tahounům farmaceutického průmyslu, což se však může brzy změnit díky současnému koronavirovému rozšíření (milovníci konspiračních teorií zvedají obočí). Nelze opomenout fakt, že významní potenciální producenti očkovacích agens proti SARS-CoV-2 viru nekonstruují vakcínu na bázi oslabených či mrtvých virů jak je běžně zvykem, ale na základě produkce (in vitro v bioreaktorech nebo in vivo v těle po vakcinaci) tzv. spike proteinů („satelitní struktury“ na povrchu viru, viz Obr. 2), které mají přítomnost koronaviru navodit a nastartovat kýženou imunitní reakci.

Obr. 2: skladba SARS-CoV-2 viru spolu s proteinovými strukturami (N Engl J Med 2020; 382:2261-2264)

V kontextu s výše uvedenými skutečnostmi stojí analytičtí chemici před úkolem, jak zvládnout charakterizaci a následnou kvantifikaci účinných látek a potenciálních nečistot. Specialisté přicházející z prostředí ortodoxních molekulárně biologických technik nastavili a formálně v direktivách ukotvili praktická a v jistých mezích i dostatečná kritéria s pomocí technik jako je ELISA a SDS-PAGE. Jiní specialisté (léta bičovaní regulemi jakosti syntetických molekul), kteří využívají moderní chromatografické postupy s vysoko rozlišující hmotnostní spektrometrií (HRMS) bývají často zaskočeni, udiveni a navrhují nekompromisní zásahy založené na masivním využití platformy HRMS. Vždyť i k biologickým léčivům lze přistupovat v komplexním analytickém pojetí (i nejprodávanější účinnou bio-látku adalimumab lze popsat sumárním vzorcem C6428H9912N1694O1987S46).

První logický krok s HRMS přístupem se nabízí provést chromatografickou separaci na reverzní fázi s následnou hmotnostně spektrometrickou analýzou. Zde platí pravidlo o nastavení co největšího rozlišení na hmotnostním spektrometru (běžně 150 000, nejlépe > 200 000 FWHM), čemuž vyhovují spektrometry s iontovou cyklotronou rezonancí nebo orbitální pastí. Díky cenové dostupnosti, bench-top uspořádání a nízkým provozním nákladům se orbitrapy (viz Obr. 3) stávají první volbou. Krásně vykreslená obálka různých nábojových stavů monoklonální protilátky ve stavu denaturovaném a nativním je znázorněna na Obr 4. Zajímavé zjištění přinese zoom jednoho nábojového klastru, resp. spektrum po dekonvoluci, kde lze elegantně pozorovat glykosylační adukty (lišící se počtem navázaných galaktózových jednotek, tj. s hmotnostním rozdílem 162), produkty posttranslační modifikace při bioprodukci. Detailní studium glykosylace může být provedeno iontově chromatografickou separací po kyselé hydrolýze (analýza monosacharidů)) nebo po glykosidázovém štěpení (analýza glykanů/oligosacharidů) nebo proteomickým bottom-up přístupem.

Obr. 3: hmotnostní spektrum adalimumabu, ESI+, rozlišení 200 000 FWHM, orbitální past

Obr. 4: princip detekce a zpracování signálu na orbitální iontové pasti

Další krok při charakterizaci biofarmak by měl směřovat k ortogonální separaci (proti reverzní fázi) na iontoměniči. Protože monoklonální protilátky a fúzní proteiny mají díky přítomnosti amino- a karboxylových skupin dostatečný náboj v širokém rozmezí pH, očekává se zajímavý profil, neboť na základě poznatků z glykosylačních studií podléhají biofarmaka rozsáhlým posttranslačním modifikacím.

Obr. 5: glykosylační adukty adalimumabu (lišící se počtem navázaných galaktózových jednotek, tj. s hmotnostním rozdílem 162), produkty posttransalční modifikace při bioprodukci

Výsledek je bez zardění překvapující. Díky vazbě až dvou molekul lysinu na C-konce protilátky a procesu vícenásobné deamidace aminokyselin asparaginu a glutaminu v řetězci proteinu dochází k tvorbě (a nikoliv na úrovni stopových množství) k řadě různě nabitých variant oddělitelných jak chromatograficky tak i hmotnostně spektrometricky, viz Obr. 6, 7 a 8.

Obr. 6: chromatografická separace finální monoklonální protilátky na iontoměniči odhalující přítomnost nábojových variant

Obr. 7: chromatografická separace adalimumabu na iontoměniči odhalující přítomnost nábojových variant (deamidace + lysinové modifikanty); HRMS spektrum dokladuje charakterizaci trojnásobného deamidačního produktu, navíc glykosylovaného, na nízké koncentrační úrovni

Obr. 8: profily jednotlivých finálních forem komerčně dostupných biofarmak z pohledu přítomnosti nábojových variant z procesu posttranslační modifikace

Studium dalších a dalších modifikací biofarmak se zdá být bezbřehé. S orbitálními pastmi lze odhalovat oxidace na methioninu a tryptofanu, tvorbu pyroglutamátů nebo např. rozpad disulfidické vazby; významná kapitola odhalování nečistot při bioprocesu je také detekce a následná eliminace proteinů z hostitelské buňky (host cell proteins). Podpora a implementace moderních chromatografických a hmotnostně spektrometrických postupů se stává klíčem k úspěšnému analytickému zvládnutí problematiky charakterizace a kvantifikace biofarmak a příbuzných nečistot.

Spektroskopická společnost Jana Marka Marci
 

Mohlo by Vás zajímat

Evaluating the Waters ACQUITY Premier System as a Flexible LC Platform That Can Be Broadly Deployed in Biopharmaceutical Labs

Aplikace
| 2021 | Waters
Instrumentace
HPLC, GPC/SEC
Výrobce
Waters
Zaměření
Farmaceutická analýza

Analysis of 510 Pesticide Residues in Honey and Onion on an Agilent 6470 Triple Quadrupole LC/MS System

Aplikace
| 2021 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Rapid Detection of Illicit Drugs and Psychoactive Plant Component by Green Technology DPiMSTM-8060

Aplikace
| 2021 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ, DART
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Forenzní analýza a toxikologie
 

Podobné články

Článek | Různé

Fyziologický ústav AV ČR: Místo, kde se přichází na kloub civilizačním chorobám

Nervová soustava, kardiovaskulární fyziologie a metabolismus – v třítaktním rytmu bije srdce Fyziologického ústavu AV ČR, který patří mezi přední vědecké instituce na poli biomedicínského výzkumu.
Článek | Produkt

Nové nástroje k identifikaci nečistot v oblasti HPLC a LC/HRMS Orbitrap

Odhalení a následná identifikace minoritních nečistot vedle hlavní komponenty, ať už ve vstupních surovinách, mezistupních či finálních produktech, se stala noční můrou mnoha analytiků.
Vědecký článek | Potraviny

Profil proanthokyanidinů v pivu a jeho surovinách

Cílem této práce byla optimalizace podmínek separace proanthokyanidinů ve vybraných pivovarských surovinách pomocí HPLC/HRMS a následně ji využít pro sledování jejich profilu během pivovarského procesu.
Vědecký článek | Potraviny

Profil proanthokyanidinů v pivu a jeho surovinách

Vypracována byla nová metoda pro stanovení proanthokyanidinů pomocí HPLC-HRMS. Metoda byla využita pro sledování změn a ověření specificity profilu proanthokyanidinů.
 

Mohlo by Vás zajímat

Evaluating the Waters ACQUITY Premier System as a Flexible LC Platform That Can Be Broadly Deployed in Biopharmaceutical Labs

Aplikace
| 2021 | Waters
Instrumentace
HPLC, GPC/SEC
Výrobce
Waters
Zaměření
Farmaceutická analýza

Analysis of 510 Pesticide Residues in Honey and Onion on an Agilent 6470 Triple Quadrupole LC/MS System

Aplikace
| 2021 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Rapid Detection of Illicit Drugs and Psychoactive Plant Component by Green Technology DPiMSTM-8060

Aplikace
| 2021 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ, DART
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Forenzní analýza a toxikologie
 

Podobné články

Článek | Různé

Fyziologický ústav AV ČR: Místo, kde se přichází na kloub civilizačním chorobám

Nervová soustava, kardiovaskulární fyziologie a metabolismus – v třítaktním rytmu bije srdce Fyziologického ústavu AV ČR, který patří mezi přední vědecké instituce na poli biomedicínského výzkumu.
Článek | Produkt

Nové nástroje k identifikaci nečistot v oblasti HPLC a LC/HRMS Orbitrap

Odhalení a následná identifikace minoritních nečistot vedle hlavní komponenty, ať už ve vstupních surovinách, mezistupních či finálních produktech, se stala noční můrou mnoha analytiků.
Vědecký článek | Potraviny

Profil proanthokyanidinů v pivu a jeho surovinách

Cílem této práce byla optimalizace podmínek separace proanthokyanidinů ve vybraných pivovarských surovinách pomocí HPLC/HRMS a následně ji využít pro sledování jejich profilu během pivovarského procesu.
Vědecký článek | Potraviny

Profil proanthokyanidinů v pivu a jeho surovinách

Vypracována byla nová metoda pro stanovení proanthokyanidinů pomocí HPLC-HRMS. Metoda byla využita pro sledování změn a ověření specificity profilu proanthokyanidinů.
 

Mohlo by Vás zajímat

Evaluating the Waters ACQUITY Premier System as a Flexible LC Platform That Can Be Broadly Deployed in Biopharmaceutical Labs

Aplikace
| 2021 | Waters
Instrumentace
HPLC, GPC/SEC
Výrobce
Waters
Zaměření
Farmaceutická analýza

Analysis of 510 Pesticide Residues in Honey and Onion on an Agilent 6470 Triple Quadrupole LC/MS System

Aplikace
| 2021 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Rapid Detection of Illicit Drugs and Psychoactive Plant Component by Green Technology DPiMSTM-8060

Aplikace
| 2021 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ, DART
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Forenzní analýza a toxikologie
 

Podobné články

Článek | Různé

Fyziologický ústav AV ČR: Místo, kde se přichází na kloub civilizačním chorobám

Nervová soustava, kardiovaskulární fyziologie a metabolismus – v třítaktním rytmu bije srdce Fyziologického ústavu AV ČR, který patří mezi přední vědecké instituce na poli biomedicínského výzkumu.
Článek | Produkt

Nové nástroje k identifikaci nečistot v oblasti HPLC a LC/HRMS Orbitrap

Odhalení a následná identifikace minoritních nečistot vedle hlavní komponenty, ať už ve vstupních surovinách, mezistupních či finálních produktech, se stala noční můrou mnoha analytiků.
Vědecký článek | Potraviny

Profil proanthokyanidinů v pivu a jeho surovinách

Cílem této práce byla optimalizace podmínek separace proanthokyanidinů ve vybraných pivovarských surovinách pomocí HPLC/HRMS a následně ji využít pro sledování jejich profilu během pivovarského procesu.
Vědecký článek | Potraviny

Profil proanthokyanidinů v pivu a jeho surovinách

Vypracována byla nová metoda pro stanovení proanthokyanidinů pomocí HPLC-HRMS. Metoda byla využita pro sledování změn a ověření specificity profilu proanthokyanidinů.
 

Mohlo by Vás zajímat

Evaluating the Waters ACQUITY Premier System as a Flexible LC Platform That Can Be Broadly Deployed in Biopharmaceutical Labs

Aplikace
| 2021 | Waters
Instrumentace
HPLC, GPC/SEC
Výrobce
Waters
Zaměření
Farmaceutická analýza

Analysis of 510 Pesticide Residues in Honey and Onion on an Agilent 6470 Triple Quadrupole LC/MS System

Aplikace
| 2021 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Rapid Detection of Illicit Drugs and Psychoactive Plant Component by Green Technology DPiMSTM-8060

Aplikace
| 2021 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ, DART
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Forenzní analýza a toxikologie
 

Podobné články

Článek | Různé

Fyziologický ústav AV ČR: Místo, kde se přichází na kloub civilizačním chorobám

Nervová soustava, kardiovaskulární fyziologie a metabolismus – v třítaktním rytmu bije srdce Fyziologického ústavu AV ČR, který patří mezi přední vědecké instituce na poli biomedicínského výzkumu.
Článek | Produkt

Nové nástroje k identifikaci nečistot v oblasti HPLC a LC/HRMS Orbitrap

Odhalení a následná identifikace minoritních nečistot vedle hlavní komponenty, ať už ve vstupních surovinách, mezistupních či finálních produktech, se stala noční můrou mnoha analytiků.
Vědecký článek | Potraviny

Profil proanthokyanidinů v pivu a jeho surovinách

Cílem této práce byla optimalizace podmínek separace proanthokyanidinů ve vybraných pivovarských surovinách pomocí HPLC/HRMS a následně ji využít pro sledování jejich profilu během pivovarského procesu.
Vědecký článek | Potraviny

Profil proanthokyanidinů v pivu a jeho surovinách

Vypracována byla nová metoda pro stanovení proanthokyanidinů pomocí HPLC-HRMS. Metoda byla využita pro sledování změn a ověření specificity profilu proanthokyanidinů.
Další projekty
Sledujte nás
Další informace
WebinářeO násKontaktujte násPodmínky užití

LabRulez s.r.o. Všechna práva vyhrazena.