Nové nástroje k identifikaci nečistot v oblasti HPLC a LC/HRMS Orbitrap | LabRulez LCMS

Nové nástroje k identifikaci nečistot v oblasti HPLC a LC/HRMS Orbitrap

St, 4.11.2020
| Originální článek z: Pragolab/Lukáš Plaček
Odhalení a následná identifikace minoritních nečistot vedle hlavní komponenty, ať už ve vstupních surovinách, mezistupních či finálních produktech, se stala noční můrou mnoha analytiků.
Video placeholder

Thermo Fisher Scientific: Vanquish Duo UHPLC System for Dual LC

Problém je zdánlivě banální – nečistota je v průběžných testech skryta pod hlavním píkem či plíživě naroste ve stresových či stabilitních studiích, kdy je produkt podroben testovaní v čase – a následný úder je mnohem bolestnější, neboť drtivá většina těchto nečistot je odhalena na HPLC s UV detekcí (v 95 % případů s mobilní fázi nekompatibilní s MS, tj. s netěkavými anorganickými pufry či iontově párovými činidly) bez jakéhokoliv náznaku strukturní informace.

Pragolab: Obr. 1: ilustrační chromatogram výskytu nečistoty ve finálním produktu

Byla již neznámá nečistota přítomna ve vstupní surovině? Objevila se jakožto degradační produkt hlavní látky? Zanesla se z výrobního procesu či migrovala z obalového materiálu (viz problematika Extractables/Leachables)? Špičkové charakterizační aparatury jako jsou vysoko rozlišující hmotnostní spektrometr (MS) či spektrometr nukleární magnetické rezonance (NMR) sice stoji opodál (v lepším případě), ale chybí propojení – jak dostat kýženou nečistotu do MS či NMR spektrometru? Nabízí se:

1) převést a optimalizovat metodu (mobilní fázi, kolonu a další podmínky) z HPLC-UV na HPLC-MS aparaturu a postupovat v identifikaci; tato varianta je časově náročná a není zřejmé a průkazné přiřazení píku nečistoty v původní a nové metodě

2) frakcionovat nečistotu v semi-preparativním nebo v opakovaném analytickém módu pomocí sběrače frakcí a následně izolovat z rozpouštědla pro MS (potažmo NMR) nevhodného (původní mobilní fáze), což je proces taktéž značně náročný (technický popis ke stažení v aplikačním listu a dokumentaci ke kolektoru)

3) provést on-line "výřez" eluující nečistoty (tzv. heart-cutting), zachytit ji na trap kolonce a nadávkovat do MS (s předraženou separací nebo bez) v druhém kanálu/dimenzi.

Pragolab: Obr. 2: frakcionační postup pří identifikaci nečistot.jpg

S vývojem duálních systémů Vanquish a plně "GMP compliance" softwaru Chromeleon, který je schopen integrovat separační, izolační a vysoko rozlišující hmotnostně spektrometrickou část (Orbitrap) se tato varianta jeví jako ideální. Navíc masivní nástup biofarmak na bázi monoklonálních protilátek (mAB), jejichž charakterizační procedura označovaná jako Multi Attribute Method (MAM) se bez MS neobejde, katapultovala Orbitrap na pomyslnou příčku strukturně analytického nástroje číslo jedna.

Nutno taktéž s respektem dodat, že chromatograficky separovat některé blízké či variantní analogy biofarmaceutických látek bez složitých – MS nekompatibilních – mobilních fází (zatím) nelze. I z těchto důvodu je rapidní rozvoj heart-cuttingu s orbitální pastí pod jedním SW (taktéž vedle zavedení ortogonální techniky ZipChip CE-MS, kapilární elektroforézy na chipu implementovaném do iontového zdroje Orbitrapu) s povděkem vítán širokou obcí strukturních analytiků na pokraji bezradnosti.

Pragolab: Obr. 3: chromatogram doprovodných variantních analogů adalimumabu.jpg

Při bližším prozkoumání schématu duálního systému Vanquish (a po překonaní přirozeného prvotního odporu k rozklíčování pozic přítomných tři vícecestných ventilů), jež byl vyvinut pro tyto účely, vyplynou následující zcela unikátní a ocenitelné vlastnosti:

  • systém lze provozovat jako 2D-HPLC se zmiňovaným heart-cuttingem
  • systém lze provozovat bez jakéhokoliv HW přenastavení jako dvě nezávislé a fluidně i teplotně oddělené jednotky (HPLC-UV a HPLC-UV-MS) se společným zásobníkem vzorků (ale dvěma oddělenými injektory)
  • obě výše uvedené varianty jsou ovládány jedním operatérem z jednoho PC, přičemž separační část sestavy zabere v laboratoři plochu jednoho HPLC.

Pragolab: Obr. 4: schéma duálního UHPLC systému Vanquish pro 2D-HPLC bez nutnosti manuálního přestavění na HPLC-UV a HPLC-UV-MS

Typická modelová situace řešená s úsměvem, bez stresu a za potlesku zúčastněných může vypadat následovně.

Strukturní analytik sjíždí sérii vzorků od svých kolegů - syntetiků a potvrzuje navržené struktury s metodou A na systému HPLC-UV-MS s Acclaim kolonou (přidává navíc elementární složení získané při rozlišeni 140 000 FWHM a navrhuje struktury přítomných intermediátů).

Vedle toho s metodou B, jež má v mobilní fázi obsažen fosfátový pufr a triethylamin, zkoumá na C18 koloně přítomnost neznámé nečistoty, kterou objevili jeho kolegové z HPLC oddělení a ve stresových testech narostla k úctyhodnému zastoupení 0,3 %; vztaženo k hlavní látce při 280 nm.

Připravuje si metodu C, do které vnáší retenční čas zkoumané nečistoty, jež bude vyříznuta z fosfátové/triethylaminové separace, fokusována a propláchnuta na on-line trap kolonce a vymyta do fáze acetonitril/voda na Acclaim kolonu a podrobena MS experimentu.

Překvapivě poté zjišťuje, že nejde o jednu nečistotu, ale dvě izomerní formy a následně navrhuje jejich elementární složení a struktury (pomocí MS/MS, mzCloud a MassFrontier).

Jde to s kolegy zapít. Nikoliv nerad, ale s rozpaky. Je toho v poslední době moc.

Po implementaci nového duálního systému Vanquish s Orbitrapem zažívá úspěchy spojené s oslavami na denní bázi.

Pragolab: Thermo Scientific Chromeleon Chromatography Data System (CDS) and Thermo Scientific Vanquish UHPLC System for 2D-LC

Pragolab
 

Mohlo by Vás zajímat

Waters XEVO G3 QTof

Brožury a specifikace
| 2022 | Waters
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS
Výrobce
Waters
Zaměření
---

Normal phase liquid chromatography assay for vitamin K1 isomers

Aplikace
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Agilent 6475 triple quadrupole LC/MS

Brožury a specifikace
| 2022 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
---

Shimadzu Liquid Chromatograph Mass Spectrometer LCMS-2050

Brožury a specifikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
---

Overcoming the challenges of liquid chromatography method transfer: A CDMO perspective

Technické články
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
---
 

Podobné články

Článek | Aplikace

Kvantifikace osmi antimykotik v lidské plazmě pomocí kapalinové chromatografie - tandemové hmotnostní spektrometrie pro klinický výzkum

Metody kvantifikace antimykotik založené na LC-MS mají lepší selektivitu a zabírají daleko méně času než tradiční HPLC metody s UV detekcí – s přístroji Thermo Scientific se to dokonce zvládne i za 3,6 minut!
Článek | Aplikace

LC-MS/MS kvantifikace volných metanefrinů v lidské plazmě pro klinický výzkum

Komplexní pracovní postup stanovení metanefrinů pomocí kombinace SPE, separace pomocí UHPLC Vanquish Flex, detekce TSQ Altis s HESI+ a vyhodnocení v aplikaci ClinMass pro stanovení volných metanefrinů v plazmě.
Článek | Produkt

Kolony Thermo EASY-Spray a Double nanoViper PepMap Neo

Nízkoprůtoková chromatografie je ideální v případech, kdy máme malý objem vzorků nebo jsou vzorky vzácné. Zejména v oblasti proteomiky.
Článek | Produkt

Rodina HPLC Vanquish

Řada HPLC Vanquish výrobce Thermo Fisher Scientific má v současné chvíli již 4 členy, kteří pokrývají všechny potřeby analytických laboratoří.
 

Mohlo by Vás zajímat

Waters XEVO G3 QTof

Brožury a specifikace
| 2022 | Waters
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS
Výrobce
Waters
Zaměření
---

Normal phase liquid chromatography assay for vitamin K1 isomers

Aplikace
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Agilent 6475 triple quadrupole LC/MS

Brožury a specifikace
| 2022 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
---

Shimadzu Liquid Chromatograph Mass Spectrometer LCMS-2050

Brožury a specifikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
---

Overcoming the challenges of liquid chromatography method transfer: A CDMO perspective

Technické články
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
---
 

Podobné články

Článek | Aplikace

Kvantifikace osmi antimykotik v lidské plazmě pomocí kapalinové chromatografie - tandemové hmotnostní spektrometrie pro klinický výzkum

Metody kvantifikace antimykotik založené na LC-MS mají lepší selektivitu a zabírají daleko méně času než tradiční HPLC metody s UV detekcí – s přístroji Thermo Scientific se to dokonce zvládne i za 3,6 minut!
Článek | Aplikace

LC-MS/MS kvantifikace volných metanefrinů v lidské plazmě pro klinický výzkum

Komplexní pracovní postup stanovení metanefrinů pomocí kombinace SPE, separace pomocí UHPLC Vanquish Flex, detekce TSQ Altis s HESI+ a vyhodnocení v aplikaci ClinMass pro stanovení volných metanefrinů v plazmě.
Článek | Produkt

Kolony Thermo EASY-Spray a Double nanoViper PepMap Neo

Nízkoprůtoková chromatografie je ideální v případech, kdy máme malý objem vzorků nebo jsou vzorky vzácné. Zejména v oblasti proteomiky.
Článek | Produkt

Rodina HPLC Vanquish

Řada HPLC Vanquish výrobce Thermo Fisher Scientific má v současné chvíli již 4 členy, kteří pokrývají všechny potřeby analytických laboratoří.
 

Mohlo by Vás zajímat

Waters XEVO G3 QTof

Brožury a specifikace
| 2022 | Waters
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS
Výrobce
Waters
Zaměření
---

Normal phase liquid chromatography assay for vitamin K1 isomers

Aplikace
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Agilent 6475 triple quadrupole LC/MS

Brožury a specifikace
| 2022 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
---

Shimadzu Liquid Chromatograph Mass Spectrometer LCMS-2050

Brožury a specifikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
---

Overcoming the challenges of liquid chromatography method transfer: A CDMO perspective

Technické články
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
---
 

Podobné články

Článek | Aplikace

Kvantifikace osmi antimykotik v lidské plazmě pomocí kapalinové chromatografie - tandemové hmotnostní spektrometrie pro klinický výzkum

Metody kvantifikace antimykotik založené na LC-MS mají lepší selektivitu a zabírají daleko méně času než tradiční HPLC metody s UV detekcí – s přístroji Thermo Scientific se to dokonce zvládne i za 3,6 minut!
Článek | Aplikace

LC-MS/MS kvantifikace volných metanefrinů v lidské plazmě pro klinický výzkum

Komplexní pracovní postup stanovení metanefrinů pomocí kombinace SPE, separace pomocí UHPLC Vanquish Flex, detekce TSQ Altis s HESI+ a vyhodnocení v aplikaci ClinMass pro stanovení volných metanefrinů v plazmě.
Článek | Produkt

Kolony Thermo EASY-Spray a Double nanoViper PepMap Neo

Nízkoprůtoková chromatografie je ideální v případech, kdy máme malý objem vzorků nebo jsou vzorky vzácné. Zejména v oblasti proteomiky.
Článek | Produkt

Rodina HPLC Vanquish

Řada HPLC Vanquish výrobce Thermo Fisher Scientific má v současné chvíli již 4 členy, kteří pokrývají všechny potřeby analytických laboratoří.
 

Mohlo by Vás zajímat

Waters XEVO G3 QTof

Brožury a specifikace
| 2022 | Waters
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS
Výrobce
Waters
Zaměření
---

Normal phase liquid chromatography assay for vitamin K1 isomers

Aplikace
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Agilent 6475 triple quadrupole LC/MS

Brožury a specifikace
| 2022 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
---

Shimadzu Liquid Chromatograph Mass Spectrometer LCMS-2050

Brožury a specifikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
---

Overcoming the challenges of liquid chromatography method transfer: A CDMO perspective

Technické články
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
---
 

Podobné články

Článek | Aplikace

Kvantifikace osmi antimykotik v lidské plazmě pomocí kapalinové chromatografie - tandemové hmotnostní spektrometrie pro klinický výzkum

Metody kvantifikace antimykotik založené na LC-MS mají lepší selektivitu a zabírají daleko méně času než tradiční HPLC metody s UV detekcí – s přístroji Thermo Scientific se to dokonce zvládne i za 3,6 minut!
Článek | Aplikace

LC-MS/MS kvantifikace volných metanefrinů v lidské plazmě pro klinický výzkum

Komplexní pracovní postup stanovení metanefrinů pomocí kombinace SPE, separace pomocí UHPLC Vanquish Flex, detekce TSQ Altis s HESI+ a vyhodnocení v aplikaci ClinMass pro stanovení volných metanefrinů v plazmě.
Článek | Produkt

Kolony Thermo EASY-Spray a Double nanoViper PepMap Neo

Nízkoprůtoková chromatografie je ideální v případech, kdy máme malý objem vzorků nebo jsou vzorky vzácné. Zejména v oblasti proteomiky.
Článek | Produkt

Rodina HPLC Vanquish

Řada HPLC Vanquish výrobce Thermo Fisher Scientific má v současné chvíli již 4 členy, kteří pokrývají všechny potřeby analytických laboratoří.
Další projekty
Sledujte nás
Další informace
WebinářeO násKontaktujte násPodmínky užití

LabRulez s.r.o. Všechna práva vyhrazena.