Příprava vzorků oligonukleotidů

Oligonukleotidy jsou vysoce specifická terapeutika používaná k léčbě širokého spektra onemocnění. V průběhu vývoje léčiv je nezbytné hodnotit farmakokinetiku terapeutických látek, což platí i pro oligonukleotidová terapeutika. Na rozdíl od nízkomolekulárních látek však oligonukleotidy představují řadu specifických analytických výzev.

Extrakci oligonukleotidů z biologických matric lze přirovnat k hledání pověstné jehly v kupce sena. I relativně jednoduché biologické matrice, jako je sérum, obsahují přibližně 70 mg/mL proteinů, asi 2 mg/mL lipidů ve formě lipoproteinů, nemluvě o významném množství solí, organických kyselin a sacharidů. Pokud se snažíme izolovat terapeutický oligonukleotid v koncentracích v rozmezí pikogramů až mikrogramů na mililitr, jedná se o velmi náročný úkol.

Tradiční metody extrakce oligonukleotidů využívají dvoukrokový postup: (1) kapalinová extrakce (LLE), při níž jsou oligonukleotidy extrahovány do vodné fáze, a následně (2) jejich izolace pomocí standardního protokolu extrakce na pevné fázi (SPE). Celý tento proces je časově náročný a obtížně automatizovatelný. Technologie Clarity™ OTX eliminuje potřebu LLE, čímž snižuje riziko tvorby emulzí a ztrát vzorku, a zároveň poskytuje platformu vhodnou pro automatizaci. Clarity OTX představuje hotové a snadno použitelné řešení pro extrakci oligonukleotidů z plazmy a séra. Obecný pracovní postup je znázorněn na Obrázku 1.

Phenomenex: Příprava vzorků oligonukleotidů

Tkáně představují obzvláště náročný typ vzorku a často vyžadují přídavek trávicích enzymů, jako je proteináza K, a použití keramických kuliček pro důkladnou homogenizaci tkáně a lýzu buněk. V závislosti na složitosti tkáňového vzorku může být rovněž nutná optimalizace kroků promývání a eluce.

Tipy pro optimalizaci metody

V případě promývacích rozpouštědel lze testovat různé organické přísady, vždy však v kombinaci s pufrovaným roztokem o pH 5,5, které je klíčové pro udržení oligonukleotidu na sorbentu, jelikož vazba probíhá na principu iontové výměny. Zvýšení obsahu organické složky nebo použití jiného organického aditiva může zlepšit vyčištění vzorku účinnější elucí kontaminantů vázaných prostřednictvím hydrofobních interakcí. Výhodou použití iontové výměny pro izolaci je možnost použití silnějších promývacích rozpouštědel za předpokladu zachování pH.

V případě eluce lze dosáhnout vyšších výtěžností zvýšením pH elučního roztoku a úpravou složení organických přísad při zachování poměru 50:50 mezi pufrem a organickou složkou. Návrhy optimalizace promývacích a elučních pufrů jsou shrnuty v Tabulce 1. Dalším doporučením pro prevenci oxidace PS na PO během elučního kroku je přídavek TCEP do elučního pufru.

Tabulka 1.   Krok / Úprava

• Promývání:
  • 50mM acetát amonný pH 5,5 : acetonitril : MeOH (50:40:10 v/v/v)
  • 50mM acetát amonný pH 5,5 : acetonitril (50:50 v/v)
  • 50mM acetát amonný pH 5,5 : acetonitril (30:70 v/v)
  • 50mM acetát amonný pH 5,5 : acetonitril : EtOAC (50:40:10 v/v/v)
• Eluce:
  • 100mM NH₄HCO₃ (pH 10) : acetonitril : THF (50:40:10 v/v/v)
  • 100mM NH₄HCO₃ (pH 10) : acetonitril : THF (50:25:25 v/v/v)

Vhodnou optimalizací extrakce oligonukleotidů pomocí Clarity OTX lze účinně vyčistit terapeutické oligonukleotidy a jejich metabolity z biologických vzorků a efektivně odstranit buněčné zbytky (například proteiny, genomovou DNA a lipidy), které mohou významně interferovat se stanovením cílových oligonukleotidových terapeutik. Odstraněním těchto kontaminantů se výrazně snižuje šum základní linie v MS, což vede k jednodušší a spolehlivější kvantitativní bioanalýze.