Použití funkce Spectral Evaluation pro kvantitativní analýzu nukleotidů a současné vyhodnocení čistoty vzorku metodou pass/fail

Výhody pro uživatele

• Použití funkce Spectral Evaluation Function k nastavení mezních kritérií a vyhodnocení pass/fail na základě libovolně zvolené vlnové délky nebo fotometrické hodnoty.
• Použití funkce Spectral Evaluation Function pro kvantitativní analýzu nukleotidů a současné vyhodnocení čistoty vzorku nukleotidů metodou pass/fail.

Úvod

UV-Vis spektrofotometry se používají ke kvantitativní analýze roztoků a v souladu s Lambert-Beerovým zákonem je množství absorbovaného světla (měřené jako absorbance) v kyvetě o konstantní optické dráze přímo úměrné koncentraci roztoku. Nukleové kyseliny se kvantifikují měřením absorbance při 260 nm, protože při této vlnové délce dochází k největší absorpci záření nukleovými bázemi.

Množství záření absorbovaného nukleovými kyselinami se však liší v závislosti na sekvenci bází, délce sekvence, použitém rozpouštědle a dalších faktorech. Pro zohlednění této variability a získání přesných kvantitativních výsledků se obvykle pro každý oligonukleotid počítá extinkční koeficient.

Absorpce nukleových kyselin je rovněž ovlivněna přítomností proteinů a dalších kontaminujících látek, které absorbují světlo v blízké vlnové délce (proteiny absorbují při 280 nm).

Tato aplikační poznámka popisuje použití UV-Vis spektrofotometru UV-1900i Plus a řídicího softwaru LabSolutions UV-Vis k měření absorpčních spekter nukleových kyselin. Následně je využita funkce Spectral Evaluation Function ke kvantitativní analýze pomocí kalibrační křivky založené na absorbancích měřených při vlnových délkách maximální absorpce. Současně je funkce Spectral Evaluation Function použita ke kontrole přítomnosti kontaminujících látek, které mohou ovlivnit kvantitativní analýzu, a to prostřednictvím vyhodnocení pass/fail čistoty vzorku nukleových kyselin na základě poměru absorbancí při 260 nm a 280 nm (OD260/OD280).

Kvantitativní analýza pomocí softwaru LabSolutions UV-Vis

Důležitým krokem kvantitativní analýzy je příprava kalibrační křivky pomocí parametru, který se mění úměrně s koncentrací. Mezi běžně používané parametry patří absorbance při pevně dané vlnové délce, nebo hodnota absorbance či plocha píku při vlnové délce maximální absorpce v definovaném spektrálním rozsahu.

LabSolutions UV-Vis je řídicí software pro UV-Vis spektrofotometry Shimadzu a obsahuje aplikace určené k provádění měření pro širokou škálu analytických požadavků. Tyto aplikace se volí prostřednictvím spouštěče LabSolutions UV-Vis (obr. 1).

Shimadzu: Obr. 1 LabSolutions UV-Vis Launcher

Aplikace „Quantitation“ (červeně označená oblast na obr. 1) umožňuje provádět kvantitativní analýzy na základě kalibrační křivky vytvořené z hodnot absorbance při pevně dané vlnové délce. Aplikace „Spectrum“ (modře označená oblast na obr. 1) a kvantitativní možnosti zpracování ve funkci Spectral Evaluation Function umožňují využít spektra zaznamenaná v určitém spektrálním rozsahu k tvorbě kalibračních křivek na základě uživatelsky definovaných kritérií, která jsou následně použita ke kvantitativní analýze analytu.

Možnosti kvantitativního zpracování ve funkci Spectral Evaluation

Funkce Spectral Evaluation

Funkce Spectral Evaluation dokáže automaticky provést předem nakonfigurovanou analýzu zaznamenaného spektra a na základě výsledku této analýzy vyhodnotit vzorek metodou pass/fail. Pro použití funkce Spectral Evaluation Function je nutné zvolit aplikaci „Spectrum“ ve spouštěči LabSolutions UV-Vis (obr. 1) a nastavit položky „Evaluation“ – „Table Settings“ – „Evaluation Items“.

Obr. 2 zobrazuje okno pokročilého nastavení funkce Spectral Evaluation Function. Mezi hodnoticí parametry, které lze zvolit, patří například point pick, maximální hodnota, minimální hodnota, pík, minimum (valley), plocha, statistika a cutoff. Tyto parametry lze použít samostatně nebo v kombinaci a podporují širokou škálu různých typů spektrálních hodnocení.

Shimadzu: Obr. 2 Okno pokročilých nastavení ve funkci spektrální evaluace

Možnosti kvantitativního zpracování

Výběr a konfigurace kvantitativních parametrů se provádí v části „Evaluation Items“ – „Quantitation“ ve funkci Spectral Evaluation Function. Obr. 3 ukazuje okno nastavení možností kvantitativního zpracování.

Shimadzu: Obr. 3 Okno nastavení možností kvantitativního zpracování

Celkem lze zvolit a kombinovat 19 různých parametrů, včetně point pick, píků a ploch, ale také barevných systémů, jako jsou hodnoty tristimulu (barevný systém XYZ) a žlutost. Výsledky kvantitativního zpracování lze kombinovat s poměrem absorbancí OD260/OD280 a dalšími hodnoticími položkami pro provádění různých typů kvantitativních hodnocení.

Provádění různých kvantitativních analýz s absorpčními spektry nukleových kyselin

Roztoky oligonukleotidu M13-F25mer byly připraveny v koncentracích 0,2 až 10,0 ng/µL postupným 10- až 500násobným ředěním pufrem (66,7 mM fosfátový pufr).

K UV-Vis spektrofotometru UV-1900i Plus byl připojen držák Super-micro cell holder a k měření spekter oligonukleotidových vzorků byla použita mikročerná kyveta s optickou dráhou 10 mm. Optická dráha 10 mm umožňuje získat spektra při nízkých koncentracích nukleotidů (1,0 ng/µL a nižších).

Shimadzu: Obr. 4 Systém UV-1900i Plus

Podrobné analytické podmínky použité pro měření absorpčních spekter jsou uvedeny níže a absorpční spektra oligonukleotidů při jednotlivých koncentracích jsou zobrazena na obr. 5.

• Přístroj: UV-1900i Plus
• Držák kyvet: Super-Micro Cell Holder
• Kyveta: mikro černá kyveta
• Spektrální rozsah: 220–400 nm
• Interval dat: 0,5 nm
• Rychlost skenování: střední
• Šířka štěrbiny: 1 nm

Shimadzu: Obr. 5 Absorpční spektra oligonukleotidu v různých koncentracích

Vlnové délky maximální absorpce jednotlivých spekter zaznamenaných na obr. 5 jsou uvedeny v tabulce 2.

Shimadzu: Tabulka 2 Vlnové délky oligonukleotidů s maximální absorpcí

Tabulka 2 ukazuje, že poloha maxima absorpce se mění v závislosti na faktoru ředění. Následně byly připraveny dvě kalibrační křivky: jedna založená na absorbanci měřené při pevně dané vlnové délce a druhá založená na absorbanci při vlnové délce maximální absorpce.

Pro kvantitativní analýzu při pevné vlnové délce byla v části „Evaluation Item“ – „Quantitation“ ve funkci Spectral Evaluation zadána hodnota 260 nm v položce „Point Pick“. Pro kvantitativní analýzu založenou na maximální absorpci byla zvolena položka „Peak“ a byl nastaven rozsah vlnových délek pro maximum absorpce a základní linii. Kalibrační křivky připravené za těchto podmínek jsou zobrazeny na obr. 6 a 7.

Shimadzu: Obr. 6 Kalibrační křivka připravená pomocí pevné vlnové délky.

Shimadzu: Obr. 7 Kalibrační křivka připravená pomocí vlnové délky s maximální absorpcí

Hodnoty druhé mocniny korelačního koeficientu (r²) na obr. 6 a 7 činily 0,99969 a 0,99992. Jak je patrné, pokud se vlnová délka maximální absorpce mění s koncentrací vzorku, lze dosáhnout přesnějších výsledků kvantitativní analýzy použitím maximální absorpce namísto pevné vlnové délky.

Vyhodnocení čistoty vzorku nukleotidů kontaminovaného příměsí metodou pass/fail

Kalibrační křivka z obr. 7 byla použita ke kvantitativní analýze neznámého vzorku a současně byla pomocí funkce Spectral Evaluation provedena kontrola čistoty nukleové kyseliny metodou pass/fail na základě poměru absorbancí OD260/OD280.

Vzorky nukleových kyselin s poměrem absorbancí 260/280 ≥ 1,8 jsou obvykle považovány za vysoce čisté a doporučují se pro analýzu pomocí sekvenátorů nové generace. Kritérium pass/fail pro čistotu bylo proto nastaveno na hodnotu 1,8 a vyšší¹).

Modelový kontaminovaný vzorek byl připraven přidáním hovězího sérového albuminu do oligonukleotidu M13-M25mer na výslednou koncentraci oligonukleotidu 0,2 ng/µL. Obr. 8 zobrazuje absorpční spektra získaná ze vzorku 1,0 ng/µL M13-M25mer a kontaminovaného vzorku 0,2 ng/µL M13-M25mer / hovězí sérový albumin, měřených za podmínek uvedených v tabulce 1.

Shimadzu: Obr. 8 Absorpční spektra vzorků oligonukleotidů.

Čistota nukleových kyselin vyhodnocená funkcí Spectral Evaluation Function pomocí metody pass/fail je uvedena v tabulce 3. Koncentrace oligonukleotidu v modelovém vzorku byla stanovena na 0,4 ng/µL a jeho poměr absorbancí 260/280 činil 1,3, což ukazuje, že přítomnost kontaminantu způsobila nesplnění kritéria čistoty nukleové kyseliny.

Shimadzu: Tabulka 3 Hodnocení čistoty nukleových kyselin vzorků pomocí funkce spektrálního vyhodnocení.

Závěr

Možnosti kvantitativního zpracování ve funkci Spectral Evaluation byly použity ke kvantitativní analýze vzorků nukleových kyselin a současnému vyhodnocení jejich čistoty metodou pass/fail. Funkce Spectral Evaluation Function umožňuje uživatelům současně měřit koncentraci nukleových kyselin ve vzorku a hodnotit jeho čistotu.

Tato funkce je rovněž velmi užitečná v případech, kdy analýza vyžaduje přesné stanovení koncentrace nukleových kyselin, například při analýze teplotní stability (Tm) nebo při analýze termodynamických parametrů nukleových kyselin.