Příprava vzorků pro peptidové mapování – osvědčené postupy pro tryptické štěpení

V oblasti bioterapeutik a biosimilárních léčiv kladou regulační orgány důraz na charakterizaci, která se primárně zaměřuje na fyzikálně-chemické vlastnosti ovlivňující účinnost, bezpečnost a imunogenicitu. Chromatografie hraje klíčovou roli ve třech hlavních oblastech této analýzy – ve struktuře vyššího řádu, primární struktuře a posttranslačních modifikacích. Jednou z klíčových technik pro určení primární struktury je peptidové mapování, které obvykle zahrnuje enzymatické štěpení purifikovaného nebo izolovaného proteinu serinovou proteázou, následované analýzou metodou HPLC. Nejběžněji používanou proteázou pro tento typ štěpení je trypsin, avšak i samotný proces štěpení lze výrazně optimalizovat pomocí osvědčených postupů. Ty budou popsány v následujícím technickém tipu.

Většina štěpení proteinů se provádí pomocí trypsinu díky jeho dobře definované specificitě. Trypsin hydrolyzuje pouze peptidové vazby, ve kterých je karbonylová skupina následována zbytkem argininu (Arg) nebo lysinu (Lys), s několika významnými výjimkami: pokud jsou Lys a Arg vázány N-koncem na záporně nabité aminokyseliny, nebo pokud je prolin (Pro) umístěn na C-konci Lys nebo Arg.

Trypsin je rovněž preferován, protože vzniklé peptidy mají bazické zbytky na C-konci, což usnadňuje jejich ionizaci při analýze hmotnostní spektrometrií – obvykle preferované detekční metodě pro tyto aplikace. Další výhodou použití trypsinu je hmotnostní rozsah vzniklých peptidů (obvykle 600–4000 Da), který je ideální pro následné analýzy metodami LC/UV nebo LC-MS/MS.

Phenomenex: Příprava vzorků pro peptidové mapování – osvědčené postupy pro tryptické štěpení

Hlavní kroky tryptického štěpení a doporučené praktiky:

Denaturace a redukce

K úplnému rozvinutí struktury proteinu tak, aby byl přístupný pro trypsin, je nutné použít chaotropní látku – běžně močovinu nebo guanidin. Močovina může snižovat pokrytí sekvence, protože se může rozložit a následně karbamylovat jak lysiny, tak cystein, a proto se jí některé laboratoře vyhýbají. Nejjednodušším činidlem pro denaturaci je guanidin hydrochlorid (GnHCl), který však musí být před štěpením odstraněn výměnou pufru, neboť inhibuje aktivitu trypsinu.

Alkylace

Mezi běžná alkylační činidla patří jodoacetamid (IAM) a jodoctová kyselina (IAA). IAM se používá nejčastěji díky rychlé reakci, ale IAA vykazuje nižší míru nespecifické alkylace. V obou případech pomáhá přidání dithiothreitolu (DTT) omezit další nespecifickou alkylaci peptidů.

Výměna pufru

Po dokončení alkylace je nezbytné odstranit zbytky alkylačních činidel a denaturačních látek. Mezi běžné metody čištění vzorku patří:

• Dialýza – umožňuje účinné odstranění kontaminantů při minimálních ztrátách vzorku, ale vyžaduje delší čas.
• Odstředivé filtry s MWCO (molecular weight cut-off) – rychlé, ale se zvýšeným rizikem ztráty materiálu.
• Desaltingové kolony – rovněž rychlé, avšak potenciálně náchylné ke ztrátám.

Štěpení

Při enzymatickém štěpení trypsinem je třeba počítat s tím, že vzniklé peptidy mohou být poměrně krátké a může docházet k neúplným štěpením. Nejčastěji se používá prasečí trypsin, který preferuje štěpení v místech s argininem (Arg), přičemž účinnost na lysin (Lys) je nižší. K dalším častým případům neúplného štěpení dochází například při přítomnosti aspartátu (Asp) nebo glutamátu (Glu) vedle Lys nebo Arg na C-konci, případně pokud je prolin (Pro) na N-konci.

Trypsin sám o sobě pokrývá pouze omezenou část proteomu. Pro dosažení úplného pokrytí sekvence je často nezbytné použití paralelních proteáz, jako jsou například AspN nebo GluC.

V případech, kdy je vyžadováno maximální pokrytí sekvence, lze dále využít i ortogonální proteázy – jejich přehled je uveden níže.

Phenomenex: Příprava vzorků pro peptidové mapování – osvědčené postupy pro tryptické štěpení

Níže je uveden přehled parametrů, které je vhodné dodržovat při štěpení proteinů trypsinem.

Phenomenex: Příprava vzorků pro peptidové mapování – osvědčené postupy pro tryptické štěpení

Závěr

Závěrem lze říci, že při charakterizaci primární struktury proteinu není určující pouze použitá analytická metoda či HPLC analýza – zásadní vliv mají také jednotlivé kroky přípravy vzorku. Správně zvolené postupy pro denaturaci, alkylaci, čištění a enzymatické štěpení výrazně zvyšují pravděpodobnost dosažení kvalitního a úplného pokrytí sekvence. Pokud jsou tyto kroky provedeny správně, následná analýza metodami HPLC nebo LC-MS/MS je výrazně jednodušší, efektivnější a poskytuje spolehlivější výsledky.