Jak na screening s novým LC/MS QTOF Revident (O. Lacina)

• Přednášející: Ondřej Lacina (Aplikační specialista LC/MS, Altium International s.r.o.)

O LC/MS s vysokým rozlišením se často dočteme, že analyty lze identifikovat na základě přesné hmoty a navíc můžete detekovat a identifikovat téměř neomezený počet látek. I když to je teoreticky pravda, je asi jasné, že praxe je mnohem komplikovanější. Nejprve si musíme uvědomit, že za identifikovaný analyt se nepovažuje pouhá shoda přesné hmoty, případně izotopové obálky, ale je nutná přítomnost specifických fragmentů nebo shoda produktového spektra. Následuje otázka volby akvizičního režimu, kterým získáme požadované fragmenty: DIA (Data Independent Analysis), nebo DDA (Data Dependent Analysis)? Jak plyne z názvu, v prvním případě se vůbec nehledí na signály, které detekujeme, a v kolizní cele se fragmentují všechny ionty, druhý jmenovaný režim naopak využívá informace o detekovaných iontech a selektivně fragmentuje pouze vybrané prekurzory. V neposlední řadě je třeba brát v úvahu, jak rychle jsme schopni analýzy zpracovat a vyhodnotit, jakou má který přístup.

Na reálných datech si ukážeme, jak koncentrace a znalost retenčního času ovlivní úspěšnost nalezení a identifikace analytů, a jak lze jednotlivé postupy kombinovat pro získání kvalitních dat a k minimalizaci falešně pozitivních nálezů, které jsou asi největší bolestí screeningových postupů.

Agilent Revident LC/Q-TOF Quadrupole Time of Flight System

Revolutionize Your Identification With Rock solid Evidence.

S Agilent Revident LC/Q-TOF se uživatelé mohou spolehnout na vynikající citlivost, rozlišovací schopnost, přesnost hmoty a dynamický rozsah. Mimoto přichází Agilent s vylepšeními hardwaru, které s sebou nesou ještě lepší specifikace, robustnost a stabilitu systému.

Altium: Agilent Revident LC-QTOF MS systém

Revident: První inteligentní LC-QTOF

• Ladění & kalibrace: SWARM autotune používá techniku „Optimalizace hejnem částic“ (Particle Swarm Optimization) ke zjištění nejlepšího nastavení celé skupiny parametrů.
• Aktivní monitoring: Early Maintenance Feedback hlásí závady, upozorňuje na pravidelné údržby systému.
• Automatizace: Automatické ladění/kalibrace m/z zajistí, že přístroj je vždy nakalibrovaný a v optimálním stavu. Kalibraci hmot i ladění lze plánovat.
• Inteligentní Reflex: Intelligent Reflex na základě předchozího nástřiku systém upraví sekvenci podle daných příkazů (carryover, rychlý screening apod).

Cílená kvantifikace × Screening

Strategie pro různé analytické úkoly

Cílená kvantifikace

• Kvantifikace cílových sloučenin pomocí standardů
• Kvantifikace sloučenin se provádí pomocí kalibračníkřivky.
• Referenční standard je nezbytný pro kvantifikaci.
• Retenční čas je znám ze standardu.
• Reportuje se koncentrace sloučeniny.

Screening

• Potvrzení přítomnosti sloučeniny.
• Referenční standard není nutný (není dostupný).
• Vyžaduje databázi sloučenin.
• Report z analýzy obsahuje detekované, nedetekované a podezřelé sloučeniny.

Screening: požadavky a nástrahy

• Potřebujeme seznam analytů! Může být velmi obsáhlý, ale nelze nalézt analyty, které na něm nejsou.
• Musíme znát sumární/strukturní vzorce analytů:
  • 1. Nalezení podezřelých píků na základě molekulových iontů: všechny možné adukty.
  • 2. Identifikace analytu spočívá ve shodě změřeného produktového spektra se spektrem v knihovně (nutná knihovna MS/MS spekter).
  • 3. Pokud není dostupná knihovna, lze provést alespoň in-silico fragmentaci a interpretace změřeného spektra se strukturou. Seriózní identifikace analytů je však možná pouze porovnáním se spektrem/standardem.

• Analyty různých fyzikálně-chemických vlastností potřebují odlišnou extrakci, chromatografii... Jsme vůbec schopni je ve vzorku analyzovat stávající technikou?
• Labilní analyty mohou fragmentovat už v iontovém zdroji → nemáme molekulový ion → nelze najít analyt a spojit jej s produktovým spektrem z knihovny!

Požadavky na identifikaci analytů pro HRMS

Document N° SANTE/11312/2021 v2, v platnosti od 1.1.2024

Altium: Požadavky na identifikaci analytů pro HRMS

All Ions MS/MS: produktové ionty pro všechny analyty

• Měření produktových iontů bez selekce prekurzoru v kvadrupólu (Q je transmisní).
• Alternace různých kolizních energií (např. 10V-20V-40V), získáváme produktová spektra kontinuálně pro všechny prekurzory přes celý rozsah m/z.
• Někdy se tomuto módu říká DIA: Data Independent Analysis.

Altium: All Ions MS/MS: produktové ionty pro všechny analyty

All Ions MS/MS: Nastavení metody

• Jednoduché nastavení akviziční metody: MS mód, pouze změny v kolizní energii.
• Vysoký duty cycle: Není potřeba přepínat do MS/MS.
• Produktové ionty na několika CE pro celý rozsah m/z

Altium: All Ions MS/MS: Nastavení metody

All Ions MS/MS: Procesování dat

1. Ve spektru bez fragmentace jsou vyhledány prekurzorové ionty a pokud je nalezen signál, vyextrahuje se i produktové spektrum.

2. V retenčním čase potenciálního analytu jsou vyextrahované chromatogramy produktových iontů z MS/MS knihovny a spočítáno jejich koeluční skore.

Knihovny: základ úspěchu (nejen) u screeningu

Bez identifikace není výsledek.

Altium: Knihovny: základ úspěchu (nejen) u screeningu

Kvantifikace a Screening v jednom SW: MH Quant 12

Nastavení kvantifikační metody pro QTOF

Kvantitativní metoda z PCDL knihovny:

• Uvažované adukty se vypočítají ze sumárního vzorce.
• Přesné m/z produktů z MS/MS spekter.
• RT pro cílové analyty – máme standard.
• Doplníme koncentrace – máme standard

Nastavení screeningové metody pro QTOF

Screeningová metoda z PCDL knihovny:

• Uvažované adukty se vypočítají ze sumárního vzorce.
• Přesné m/z produktů z MS/MS spekter.
• NEznáme RT pro cílové analyty – NEmáme standard.
• NEdoplníme koncentrace – NEmáme standard.

Altium: Kvantifikace a Screening v jednom SW: MH Quant 12

Odvrácená strana mince…

All Ion MS/MS mód trpí na velké množství interferencí, především ve spektrech s fragmentací.

Nutné revidovat výsledky, jinak hrozí falešně negativní nálezy.

Řešení: Použít z knihovny více fragmentů, interference obvykle není na všech iontech.

Mnohem častější jsou díky interferencím falešně pozitivní chyby.

Řešení:

• Více produktových iontů potřebných pro identifikaci.
• Zvýšit požadované koeluční skóre.
• Zvýšit požadované MS skóre.
• Přidat RT analytů.

Zpřísnění pravidel pro identifikaci analytů může vyřadit i pozitivní nálezy!

Vliv znalosti RT na výsledek screeningu

• Tři matrice: Jablka × Pomeranče × Zelený čaj
• Tři koncentrace: 4, 20 a 100 ng/g.
• Spike: 341 pesticidů
• Agilent 1290 LC + Agilent Revident QTOF
• Nástřik: 1 μl
• Kolona: Agilent Zorbax EC-C18 100×2.1; 1,8 μm
• Ionizace: ESI+

Altium: Vliv znalosti RT na výsledek screeningu

Jak přidat retenční časy analytům, které neznáme?

Retention time prediction

Matematické modelování retence analytů na HPLC koloně.

• Změření skutečných RT stovek různých analytů.
• Trénování modelu: Vložení všech známých parametrů analytů (hmotnost, funkční skupiny, polarita, pKa, logP apod) do vybraného modelu.
• Predikce RT analytů na základě znalosti všech chemicko-fyzikálních parametrů analytu (i teoreticky vypočtených).

HighResNPS

• Uzavřenou komunitou vyvíjená HRMS databáze nových psychoaktivních substancí s produktovými spektry.
• Přibližně 2,300 analytů; 1,658 analytů má produktová spektra.
• Databáze obsahuje retenční časy na základě vlastního predikčního modelu.

Agilent Forensic Toxicology PCDL

• Pečlivě zkontrolovaná a uspořádaná HRMS knihovna pro LC-QTOF Agilent, součást ChemVista.
• Obsahuje přes 9200 analytů, pro asi 4400 analytů jsou změřená a revidovaná MS/MS spektra.

HighResNPS + Agilent Forensic Toxicology PCDL

Stále ve fázi vývoje, ale je na co se těšit:

• Metoda pro forenzní toxikologii, cca 5000 analytů s MS/MS spektry.
• Změřené a predikované retenční časy pro tři chromatografické metody s délkou separace 25/15/10 min.
• Plán predikce RT pro všech > 12 000 analytů v ChemVista.

Další témata prezentace

• Validace modelu pro predikci RT (Predikce RT pro ≈ 2500 na základě 700 změřených standardů.)
• Využití predikovaných RT (Izomery fluoromethamphetaminu (FMA))
• Inteligentní Reflex: Screening a konfirmace (Jak automaticky snížit množství falešně pozitivních nálezů…)

Závěr

Komplexní hardwarové a softwarové řešení od Agilent pro efektivní screening velkého množství analytů:

• Současná kvantifikace a screening analytů v MH Quant 12.
• Přehledná filtrace pozitivních nálezů v MH Screener.
• Jednoduchá tvorba vyhodnocovací metody z PCDL knihovny.
• „Target MS/MS Confirmation“ inteligentní reflex pro redukci falešně pozitivních nálezů.

• ChemVista Applied Market
  • > 14 000 analytů, přes 6000 látek má MS/MS spektra
  • > 35 000 analytů ve veřejných knihovnách MassBank EU a MoNA.
• HighResNPS
  • Predikce retenčních časů může významně zlepšit (a zrychlit)
    identifikace analytů při screeningu.

Výběr nejnovější literatury pro LC/Q-TOF Agilent Revident v knihovně LabRulezLCMS

• Intelligent Reflex Targeted Reinjection Workflow for Pesticide Screening in Food Matrices (Aplikace | 2024)
• Targeted Data Mining and Annotation of Untargeted High-Resolution Lipidomics Data (Aplikace | 2024)
• Illuminating the Cellular and Molecular Response to Drug Treatment by Combining Bioenergetic Measurements with LC/MS Omics (Aplikace | 2024)
• Toxicological Drug Screening Using the LC Screener Tool with High-Resolution LC/Q-TOF (Aplikace | 2024)
• High-Confidence Targeted Data Mining of Untargeted High-Resolution Data for Lipids (Poster | 2023)
• Combined LC/MS and GC/MS Approach for Analysis of Extractables and Leachables in Complex Matrices Using High Resolution Mass Spectrometry (Poster | 2024)
• Illuminating the Cellular and Molecular Response to Drug Treatment by Combining Bioenergetic Measurements with Untargeted Metabolomics (Poster | 2023)
• A hybrid simulation-experimental approach for the design of a mass spectrometer pumping system (Poster | 2023)
• Ultra-Fast Multiresidues Accurate Mass Screening Strategy (Poster | 2024)
• From data-independent acquisition (DIA) to targeted MS/MS: Automatic reinjection for additional confirmation in suspect screening (Poster | 2023)
• Uncovering More Biological Insights in Your Samples with Routine LC/Q-TOF Workflows for Metabolites and Lipids (Poster | 2024)
• Routine Pesticide Screening Solution: Data Independent Acquisition with a New LC/Q-TOF and Dedicated Screening Software (Poster | 2023)
• Routine Targeted Metabolomic Panel Analysis from Untargeted Acquisition of Differing Mouse Plasma Populations (Poster | 2024)
• Comparative Study of High-Resolution Q-TOF Fast Polarity Switching versus Single Polarity Data Acquisition on Mass Accuracy, Resolution and Analytical Sensitivity (Poster | 2024)