Škálovatelnost kolon plněných částicemi s pevným jádrem pro chromatografické analýzy

Kapalinová chromatografie (HPLC) je technika, která hraje klíčovou roli v mnoha oblastech vědy. Je standardně používaná ke kontrole kvality léčiv a biologických látek, ve výzkumu a lékařství [1]. V posledních několika desetiletích se vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) stala pro tyto vědní obory analytickou metodou první volby. Typické HPLC systémy pracují s tlakem do 6000 psi [2] s tím, že běžně využívají chromatografické kolony plněné částicemi s průměrem 3 - 5 μm. Ačkoli kolony s menšími částicemi umožňují rychlejší separace, je jejich použití v HPLC je omezeno na kratší délky kvůli zvýšeným pracovním tlakům [3]. Kromě toho zavedené a validované metody mohou omezovat změny velikosti částic nebo konfigurace kolony.

Pozvánka: Waters seminář VIZE 2024

Termín: 19. listopad 2024 (09:00-14:00)
Místo: Hotel International Brno

• REGISTRACE - prezenčně (kapacita naplněna)
• REGISTRACE - on-line stream

Lepší účinnosti HPLC kolony lze dosáhnout použitím částic s pevným jádrem. Částice s pevným jádrem mají neporézní „pevné“ jádro a porézní vnější vrstvu [4]. Kolony plněné částicemi s pevným jádrem nabízejí zřetelnou výhody oproti těm, které jsou plněny plně porézními částicemi, zejména vyšší účinností a nižším provozním tlakem. Společnost Waters nabízí řadu kolon plněných částicemi s pevným jádrem známou jako kolony CORTECS^TM. 

Použitím kolon CORTECS^TM může být dosaženo jak zvýšení účinnosti separace, tak i zvýšešní rychlosti analýz či snížení objemu rozpouštědel při snížení tlaku v systému oproti konfiguracím s využívající konvenční pórezní častice.  V tomto posteru se zabýváme využitím kolon s pevným jádrem z hlediska škálovatelnosti. Porovnávány jsou kolony plněné 5 μm CORTECS^TM Prototype Material, CORTECS UPLC^TM (1.6μm) a CORTECS HPLC (2,7 μm) C18 Material s kolonami plněnými plně porézními částicemi. Navíc, jsou zde porovnány kolony CORTECS s podobnými komerčními produkty.

Metody

STUDIE 1: TLAK SYSTÉMU A ÚČINNOST 

• LC Systems: ACQUITY UPLC I-Class System with TUV Detector
• Columns:
  • 1.6 μm CORTECS UPLC C18 Column
  • 2.7 μm CORTECS HPLC C18 Column
  • 5 μm CORTECS C18 Prototype Column
  • 1.7 μm ACQUITY BEH C18 Column
  • 3.5 μm XBridge BEH C18 Column
• Flow Rate(s): 0.04 to 1.40 mL/min
• Mobile Phase: Acetonitrile: Water (75:25, v/v)
• Injection Volume: 0.4 μL
• Sample Mixes (μg/mL):  thiourea (0.01), naphthalene (0.05), acenaphthene (0.20)

STUDIE 2: ŠKÁLOVATELNOST

• LC Systems: ACQUITY UPLC System with TUV Detector
• Columns:
  • 1.6 μm CORTECS UPLC C18 Column
  • 2.7 μm CORTECS HPLC C18 Column
  • 5 μm CORTECS C18 Prototype Column
  • Vendor H Columns - 2, 2.7, 5 μm
  • Vendor A Columns -  1.9, 2.7, 4 μm
• Flow Rate(s): 0.25 mL/min
• Mobile Phase: Acetonitrile: 15.4 mM Ammonium Formate pH 3.00 (35:65, v/v)
• Injection Volume: 3.0 μL
• Sample Mixes (μg/mL): uracil (1), pyrenesulfonic acid (6.5), amitriptyline (8), promethazine (3), butylparaben (3.5), naphthalene (20

Konfigurace kolon v této studii byla 2.1 x 50 mm přo všechny testované kolony/set-upy. Kolony byly používány při konstatní teplotě 30°C. Analyty byly detekovány pomocí ACQUITY UPLC TUV Detector při 254 nm.

Výsledky a diskuze

STUDIE 1: TLAK SYSTÉMU A ÚČINNOST

Omezené provozní tlaky systému jsou jednou z největších nevýhod HPLC systémů. Obrázek 1 porovnává dosažené provozní tlaky kolon plněných plně porézními částicemi BEH C18 o dvou průměrech s tlaky dosaženými při použití kolon s povrchově porézními částicemi CORTECS C18 se třemi velikostmi částic. 

Waters: Obrázek 1: Srovnání protitlaku v koloně v závislosti na průtoku u různých kolon a velikostí částic, včetně plně porézních kolon XBridge BEH C18 a kolon CORTECS C18 s pevným jádrem.

Kolony s menší velikostí částic, jako je ACQUITY BEH C18 (průměr částic 1,7 μm) či CORTECS C18 (1,6 μm ) mohou dosahovat daleko vyšších provozních tlaků, než za jakých je možné provozovat klasické HPLC systémy. Kolona CORTECS C18 (2.7 μm) v kratších délkách pak běžně dosahuje tlaků klasické HPLC, tj. do 6000. Naopak při použití delších kolon, může být tento HPLC limit překročen.

HPLC metody, které využívají kolony s plně pórezními částicemi 3.5 μm, dosahují tlaku přibližně 2500 psi průtoku 1.4 ml/min, což je nižší tlak ve srovnání s kolonou CORTECS C18 s částicemi 2.7 μm. Naopak kolona CORTECS C18 (5μm) Prototype pracuje při ještě nižším tlaku (cca 1800 psi), což je o 28 % méně než u kolony XBridge C18 BEH 3,5 μm. Tento výrazný pokles tlaku zajišťuje dlouhou životnost HPLC systému (zjeména pak čerpadla, ventily a kapiláry) bez snížení účinnosti systému. 

Waters: Obrázek 2: Srovnání účinnosti kolony v závislosti na průtoku pro 3,5 μm kolonu XBridge BEH C18 a 5 μm prototypovou kolonu CORTECS 18.

Účinnost kolony, obvykle vyjádřená jako počet teoretických pater (N), vyjadřuje schopnost kolony generovat úzké píky. Čím účinnější kolona je, tím užší píky generuje. Obrázek 2 znázorňuje graf porovnávající účinnost kolony v závislosti na průtoku pro dvě různé kolony: CORTECS C18 Prototype (5 µm) a kolony XBridge BEH C18 (3.5 μm). Zajímavé je, že 5 µm kolona CORTECS C18 Prototype, navzdory většímu objemu vykazuje optimální účinnost, která je o 14 % vyšší než u kolony 3,5 um XBridge BEH C18 Column. Proto 5 µm kolona CORTECS C18 Prototype překonává v účinnosti kolonu 3.5 um XBridge BEH C18.

STUDIE 2: ŠKÁLOVATELNOST

Šest různých vzorků bylo analyzováno ze použití mobilní fáze ve složení acetonitril: 15.4 mM mravenčan amonný (35:65) při průtoku 0.25 ml/min. Kolony CORTECS a CORTECS Prototype Columns o různých velikostí částic byly testovány za stejných podmínek. Tři kolony plněné částicemi s pevným jádrem o různých velikostech částic od dvou různých komerčních dodavatelů byly rovněž testovány za stejných podmínek, jak je znázorněno na obrázku 3.

Škálovatelnost je pro uživatele HPLC zásadní z několika důvodů. Například metody vyvinuté na kolonách s menší velikostí částic (např. sub-2 μm) jsou často optimalizovány pro dosažení vysoké rychlosti či účinnosti. Tyto kolony však nejsou vždy vhodné pro rutinní měření kvality (QC) kvůli vyšším provozním tlakům. Proto je nutné zajistit, aby kolony byly škálovatelné napříč velikostmi částic a mohly být využívány pro QC. 

Waters: Obrázek 3: Chromatogramy kolon CORTECS C18 s různou velikostí částic ve srovnání s kolonami prodejce H a prodejce A. 1) uracil 2) kyselina pyrenesulfonová 3) promethazin 4) amitriptylin 5) butylparaben 6) naftalen.

Obrázek 3 zdůrazňuje důležitost škálovatelnosti podle velikosti částic. Kolony CORTECS jsou škálovatelné, protože retenční časy jsou podobné u všech tří velikostí částic. Oproti tomu je z tohoto srovnání patrné, že kolony komerční produkt výrobců H a A však neposkytují stejnou škálovatelnost, protože retenční časy jsou u kolon s větší velikostí částic (5 a 4 µm) výrazně posunuty. U výrobců H a A mohou být nižší retenční časy u kolon s větší velikostí částic způsobeny rozdíly, jako je nestejná hodnota rho u různých velikostí částic, resp. poměru průměrem pevného jádra a průměrem celé částice). Hodnota rho má významný vliv na retenci, a tím i na škálovatelnost, protože čím více se hodnota rho blíží 1, tím více se vnější vrstva porézního materiálu se stává tenčí, což vede k menšímu povrchu, a tím i k nižší retenci. Kolony CORTECS a prototypové kolony CORTECS o průměru 5 μm byly vyvinuty tak, aby splňovaly požadavky uživatelů HPLC, kteří hledají produkt, který nejenže snižuje tlak sytému a zlepšuje účinnost, ale také umožňuje škálovatelnost napříč LC systémy.

ZÁVĚR

• 5 μm prototypové sloupce CORTECS mají o 28 % nižší protitlak ve srovnání s prototypy CORTECS
  3.5 μm kolony XBridge BEH C18.
• 5 μm kolony CORTECS Prototype mají o 14 % vyšší optimální účinnost v porovnání s kolonami 3.5 μm XBridge BEH C18.
• Kolony CORTECS jsou škálovatelné ve všech 3 uvedených velikostech částic.
• Pro srovnání, kolony prodejce H a A nejsou škálovatelné ve všech 3 velikostech částic z důvodu výrazně nižší retence u částic o velikosti 4 a 5 μm, jak je znázorněné na obrázku 3.