Využití SPE a SPME při analýze piva

K moderním a stále více se prosazujícím metodám přípravy vzorků při analýze senzoricky aktivních látek v pivu patří extrakce na pevné fázi (SPE) a mikroextrakce na pevné fázi (SPME).

Vzhledem k stále se rozšiřující nabídce různých sorbentů pro SPE a fází pro SPME bylo na příkladu stanovení mastných kyselin v pivu provedeno porovnání 11 SPE kolonek jednak z hlediska různých výrobců téhož typu sorbentů a jednak různých typů sorbentů, a dále pak porovnání 3 typů SPME vláken. V práci jsou porovnány pracovní charakteristiky SPE a SPME metody. Vlastní stanovení mastných kyselin probíhalo na plynovém chromatografu Chrompack CP 9001 vybaveném křemennou kapilární kolonou SPB-1000 (Supelco, délka 30 m, průměr 0,32 mm a tloušťka filmu 0,25 μm) a plamenoionizačním detektorem.

1 ÚVOD

K nejpoužívanějším metodám pro přípravu vzorků piva k analýze senzoricky aktivních látek patří destilace s vodní párou, extrakce v systému kapalina-kapalina a headspace technika. Tyto postupy se často vyznačují časovou náročností a používáním organických rozpouštědel, která navíc mohou být zdraví škodlivá. V současné době stále stoupají požadavky na rychlost a zároveň spolehlivost analytických metod společně s ekonomickými aspekty. K typickým příkladům metod pro přípravu vzorků vyhovujícím dnešním nárokům patří extrakce na pevné fázi (SPE) a mikroextrakce na pevné fázi (SPME).

SPE je extrakční metoda pracující s pevnou a kapalnou fází. S úspěchem nahrazuje klasickou extrakci v systému kapalina-kapalina. Kapalná fáze obsahuje stanovované látky včetně dalších látek obsažených v matrici. Princip spočívá v zachycení sledovaných analytů, které jsou obsaženy v kapalné fázi, na speciálním sorbentu díky silným, ale vratným interakcím mezi analytem a povrchem stacionární fáze, přičemž by nemělo dojít k interakcím mezi stacionární fází a složkami matrice. Mezi typické interakce patří hydrofobní van der Waalsovy síly, polární vodíkové můstky, síly dipól-dipól nebo iontově výměnné interakce. Sorbent je umístěn mezi fritami v extrakční minikolonce určené na jedno použití. Cílem tohoto postupu je jednak odstranění interferujících látek obsažených v matrici a jednak izolace a zkoncentrování (100x-5000x) stanovovaných látek.

Díky jednoduchosti a snadnému použití SPE vyústil zájem o tuto techniku ke komerčnímu používání jednorázových minikolonek. Tyto kolonky jsou plněny různými sorbenty o různé velikosti částic. K přetlačení vzorku a promývacího roztoku skrze kolonku je díky velikosti částic možné použít nízkého tlaku. Jako sorbenty se nejčastěji používají modifikovaný i nemodifikovaný oxid křemičitý, oxid hlinitý, polymery atd. Pro obrácenou fázi jsou k dispozici oktadecyl (C₁₈), oktyl (C₈), etyl (C₂), cyklohexyl, fenyl, butyl (C4). Pro normální fázi se používá oxid křemičitý modifikovaný skupinami kyano (-CN), amino (-NH₂), dioly (-COHCOH). Pro adsorpci se využívá silikagel (-SiOH), florisil (Mg₂SiO₂), oxid hlinitý (Al₂O₃). K iontové výměně se využívá skupin amino (-NH₂), kvarterního aminu (N⁺), karboxylové skupiny (-COOH), aromatické sulfonové kyseliny (ArSO₂OH) nebo polyetyleniminu (-(CH₂CH₂NH)n-).

Velmi důležitým kritériem umožňujícím vysokou opakovatelnost analytických výsledků je zajištění konstantní kvality různých šarží jednorázových SPE kolonek. K tomuto účelu se jako charakteristika SPE kolonky používá kapacita kolonky. Kapacita se vyjadřuje jako poměr mg analytu/g sorbentu a znamená, že za stejných podmínek různé šarže kolonek adsorbují a desorbují stejné množství analytu. Stejnoměrnou kvalitu šarží dnes většinou firmy garantují certifikovaným procesem výroby SPE kolonek.

Metoda SPE zahrnuje čtyři po sobě jdoucí kroky.

1. Kondicionace sorbentu. V tomto kroku se SPE kolonka připraví na interakci se vzorkem. Často se provádí methanolem, vodou nebo pufrem. Jde o nezbytný krok pro reprodukovatelnou sorpci analytů.

2. Aplikace vzorku. Vzorek se pomocí vakua prosaje skrz kolonku. Sledované analyty se zachytávají v úzké zóně na sorbentu. Část interferujících látek z matrice projde kolonkou přímo do odpadu, část se adsorbuje.

3. Promytí. Zachycené interferující látky matrice jsou odstraněny z povrchu stacionární fáze.

4. Eluce. V tomto kroku dochází k selektivní desorpci analyzovaných látek pomocí vhodného rozpouštědla (1, 2).

Při vývoji SPE metody je nutné zvážit následující hlediska:

1. Stanovení cíle metody pro přípravu vzorků. Jak vysoké výtěžnosti musíme dosáhnout? Jak vysokého stupně odstranění interferujících látek musíme pro koncovou analýzu dosáhnout? Bude dosažené zkoncentrování dostatečné pro konečnou analýzu? Jaké rozpouštědlo je optimální pro sledované analyty? Jaké prostředky jsou dostupné pro vývoj metody a pro rutinní analýzu?

2. Zvážit vlastnosti vzorku – jak matrice, tak sledovaných analytů. Jaká je matrice vzorku, je silně polární nebo nepolární? Jak velký je objem vzorku? Jaké funkční skupiny mohou mít vliv na rozpustnost analyzovaných látek – polarita, disociační konstanta, atd.?

3. Na základě výše uvedených bodů je nutné zvolit retenční mechanismus, typ fáze, množství sorbentu a vhodnou velikost SPE kolonky, která by nejlépe vyhovovala vlastnostem vzorku a cílům kladeným na přípravu vzorku. Obecně platí, že hmotnost analytu, který má být sorbován, by měla být maximálně 5 % hmotnosti sorbentu. Co se týče velikostí SPE kolonek do objemu 1 ml vzorku se používá 1 ml kolonka. 3 ml kolonka je vhodná od 1 ml do 250 ml vzorku, 6 ml kolonka od 1 ml do 250 ml pro rychlou předseparaci, 12, 20 a 60 ml kolonky se využívají pro objemy vzorků od 10 ml do 1 litru.

4. Prostřednictvím experimentů s roztoky standardů optimalizovat dávkování a vymývání, určit chování analytu na sorbentu v závislosti na změně extrakčních podmínek. Na základě těchto experimentů zoptimalizovat podmínky pomocí pokusů s reálnou matricí, s použitím obohacených vzorků zjistit výtěžnost, opakovatelnost, čistotu získaného extraktu. Nakonec je třeba celou metodu zvalidovat (3).

Při analýze piva a dalších nápojů se SPE metoda používá např. pro stanovení vyšších aromatických alkoholů (tyrosol, tryptofol, guajakol) (4), mastných kyselin (5, 6), furfuralu, hydroxymethylfurfuralu (7), iso-α-hořkých kyselin (8), ATNC (zdánlivých celkových N-nitrososloučenin) (9), biogenních aminů (10), sacharinu (11).

Mikroextrakce na pevné fázi – SPME – je adsorpčně/desorpční technika vyvinutá Pawliszynem na University of Waterloo v 1. pol. 90. let a patentovaná firmou Supelco. Je vhodná především pro stanovení těkavých látek jako alternativa ke klasické headspace technice. Princip použití a způsob vzorkování byl už v Kvasném průmyslu popsán (12).

Technika SPME se v pivovarské analytice využívá např. pro stanovení nižších alkoholů a esterů (13, 14), vicinálních diketonů (15), dimethylsulfidu (16) nebo mastných kyselin (17).

Předložená práce se na příkladu stanovení mastných kyselin zabývá porovnáním jedenácti SPE kolonek a dále pak porovnáním tří typů SPME vláken.

2 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

2.1 Použité materiály, standardy

V práci byly použity SPE kolonky fy Merck: LiChrolut EN 200 mg/3 ml (ethylvinylbenzen divinylbenzen polymer s extrémně velkým specifickým povrchem), LiChrolut RP-18 200 mg/3 ml, LiChrolut RP-18 500 mg/3 ml; Varian: Abselut Nexus LRC 60 mg (polymerní sorbent nevyžaduje kondicionaci, a tak se celý SPE proces redukuje ze čtyř kroků na tři (pro nepolární látky); Agilent Technologies: Zorbax C18-EC 500mg (oxid křemičitý velmi vysoké čistoty); Phenomenex: Strata C18-E 200 mg/3 ml, Strata X 200 mg/6 ml (polymer), Strata SDB-L 200mg/3 ml (styren divinylbenzen); Supelco: Discovery DSC-18 500 mg/3 ml (polymerně vázaný oktadecyl), Discovery DSC-18LT 500 mg/3 ml (monomerně vázaný oktadecyl – 11 % C), Supelclean ENVI-CARB 250 mg/3 ml (grafitizovaný neporézní uhlík).

Pro SPME metodu byla odzkoušena vlákna: Carbowax/DVB – 65μm, PDMS – 100 μm a Carboxen/PDMS, 75 μm (vše Supelco). Kyselina butanová (máselná), pentanová (valerová), hexanová (kapronová), heptanová, oktanová (kaprylová), nonanová (pelargonová), dekanová (kaprinová), undekanová, dodekanová (laurová), tridekanová, tetradekanová (myristová), pentadekanová, hexadekanová (palmitová), heptadekanová, oktadekanová (stearová), oktadekadienová (linolová), oktadekatrienová (linolenová), oktadecenová (olejová) – Supelco. Methylestery kyselin oktanové, dekanové, dodekanové, tridekanové, tetradekanové, pentadekanové, hexadekanové, heptadekanové, oktadekanové, oktadekadienové, oktadekatrienové, oktadecenové – Supelco.

Derivatizační činidlo BF₃ – methanol 14% – Fluka.

2.2 Metoda

Nižší mastné kyseliny C₄–C₁₂ byly po extrakci metodou SPE stanoveny jako volné kyseliny, zatímco vyšší mastné kyseliny C₁₄–C₁₈ byly analyzovány ve formě methylesterů po derivatizaci pomocí BF₃ ve 14% methanolu. Postup extrakce vycházel z práce (6).

Způsob extrakce nižších mastných kyselin C₄–C₁₂ metodou SPME byl založen na metodě popsané v práci (17).

Vlastní analytické stanovení probíhalo na plynovém chromatografu Chrompack CP 9001, který byl vybaven automatickým dávkovačem Labio ASG 40. Chromatografická separace probíhala na 30 m dlouhé křemenné kapilární koloně SPB-1000 firmy Supelco s vnitřním průměrem 0,32 mm a tloušťkou filmu 0,25 μm. Kolona byla temperována na 120 °C po dobu 2 min, poté následoval teplotní gradient 10 °C/min do teploty 150 °C a následně 30 °C/min až do teploty 200 °C. Při této teplotě kolona zůstala po dobu 15 min. Injektor i plamenoionizační detektor (FID) byly vyhřáty na teplotu 250 °C. Při analýze vzorků extrahovaných metodou SPE byl nástřik prováděn v režimu split 1:10. Při stanovování analytů extrahovaných metodou SPME byl nástřik prováděn ve splitless módu, split ventil byl otevřen po uplynutí 0,5 min. Jako nosný plyn bylo využito helium v kvalitě 5.0, tlak na koloně byl 100 kPa při 75 °C.

Methylestery vyšších mastných kyselin byly analyzovány za stejných chromatografických podmínek.

3 VÝSLEDKY A DISKUSE

Porovnání účinnosti jednotlivých SPE kolonek při extrakci mastných kyselin o přibližné koncentraci každé kyseliny 2,0 mg/l v modelovém roztoku 5% ethanolu včetně cenového srovnání uvádí tab. 1.

Tab. 1 Porovnání extrakční účinnosti SPE kolonek včetně cenového srovnání

Porovnání SPME vláken ukazuje tab. 2.

Tab. 2 Porovnání extrakční účinnost SPME vláken

Z výsledků je vidět, že stejné typy sorbentů (LiChrolut RP-18, Strata C18-E, Discovery DSC-18) poskytují pro nižší mastné kyseliny srovnatelné výsledky. Lepších výsledků bylo dosaženo na kolonce Zorbax C18-EC, bohužel dle sdělení dodavatele se tento sorbent obsahující vysoce čistý oxid křemičitý již nedodává.

Polymerní sorbenty (LiChrolut EN, Abselut NEXUS LRC, Strata X, Strata SDB-L) i grafitizovaný uhlík dosahují pro nižší mastné kyseliny výrazně vyšší extrakční účinnosti.Naopak extrakce vyšších mastných kyselin je podstatně nižší než u klasických C-18 sorbentů. Nevýhodou je také vyšší cena.
Jak vyplývá z tab. 2, nejlepších výsledků při extrakci nižších mastných kyselin z modelového roztoku bylo dosaženo použitím SPME vlákna pokrytého fází 65 μm Carbowax-Divinylbenzen.

Vzhledem k tomu, že při stanovení mastných kyselin v pivu se nejedná o stopové koncentrace, není nutné použít materiál dosahující nejlepších extrakčních schopností. Pracovní charakteristiky SPE metody tedy byly zjištěny pro ekonomicky nejvýhodnější sorbent Strata C18-E 200 mg/3 ml. Pro SPME metodu bylo využito vlákno Carbowax-Divinylbenzen.

Správnost metody byla ověřena pomocí výtěžnosti. Nejprve byl změřen přirozený obsah volných mastných kyselin v deseti reálných vzorcích piv. Poté byly tytéž vzorky piv obohaceny přídavkem mastných kyselin na koncentrační hladině 2 mg/l každé látky. Opakovatelnost metody byla zjištěna opakovanou analýzou jednoho a téhož vzorku piva (10krát během jednoho dne).

Výsledky uvedené v tab. 3 ukazují, že pro stanovení kyselin kapronové až laurové jsou metody SPE a SPME srovnatelné. Při menším počtu vzorků je z časového hlediska a větší jednoduchosti výhodnější metoda SPME. Na druhé straně při měření větší série vzorků je při využití automatického dávkování vzorků do plynového chromatografu výhodnější metoda SPE. Touto metodou je navíc možné proměřit větší spektrum mastných kyselin. Derivatizace extraktu získaného SPE technikou pomocí BF₃ v 14% methanolu je jednoduchá a bezpečná na rozdíl od derivatizace diazomethanem na SPME vlákně. Výrazně nižší výtěžnost kyselin máselné a valerové je zřejmě důsledkem jejich vyšší těkavosti způsobena ztrátami při vysušování kolonky.

Tab. 3 Výtěžnost a opakovatelnost SPE a SPME metody pro stanovení mastných kyselin v pivu (CV – variační koeficient)

4 ZÁVĚR

SPE a SPME metody přípravy vzorků představují velmi silný nástroj zefektivnění provádění analytických rozborů. Na trhu je dostupná široká nabídka různých sorbentů od různých výrobců, se kterými lze, jak bylo demonstrováno na příkladu stanovení mastných kyselin v pivu, dosáhnout velmi dobrých výsledků. Vždy je nutné zvážit požadavky, které budeme na metodu klást. Z uvedeného příkladu je patrné, že i ekonomicky nejvýhodnější sorbent může v konkrétním daném případě poskytnout naprosto vyhovující parametry.