LCMS
Další informace
WebinářeO násKontaktujte násPodmínky užití
LabRulez s.r.o. Všechna práva vyhrazena. Obsah dostupný pod licencí CC BY-SA 4.0 Uveďte původ-Zachovejte licenci.
Autor
2 THETA ASE
2 THETA ASE, s.r.o. byla založena v roce 2000. Rozsah jejích činností zahrnuje obchod s laboratorními přístroji, vybavením laboratoří, referenčními materiály, nástroji a zařízením pro odběr a úpravu vzorků, atd. Firma také organizuje odborné a vzdělávací akce a zajišťuje pomoc při aplikacích mikrovlnné techniky ve výzkumu a výrobě.
Tagy
Článek
Akademie
Produkt
Logo of LinkedIn

Organická analýza - SPEKTRÁLNÍ METODY - Luminiscenční metody

St, 19.6.2024
| Originální článek z: 2 THETA/Vlastimil Kubáň
Pravidelný seriál z vybraných kapitol knihy Organická analýza. Další díl se věnuje luminiscenčním metodám.
**Foto:** 2 Theta: Organická analýza

Foto: 2 Theta: Organická analýza

10.2 Luminiscenční metody
  • 10.2.1 Úvod do luminiscenčních metod
  • 10.2.2 Instrumentace
  • 10.2.3 Příklady aplikací

Kniha obsahuje přehled metod analýzy organických látek: Analytikům prohloubí jejich znalosti používaných metod a vedoucím pracovníkům poskytne podklady pro řešení úkolů jejich laboratoře. Je určena také pro studenty a vyučující univerzit a vědecké pracovníky.

💡 Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci Organická analýza, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.

Úvod do luminiscenčních metod

Luminiscence je děj, při kterém je molekula převedena ze základní molekulové hladiny S₀ do některé energeticky vyšší energetické hladiny (excitovaného stavu S₁) absorpcí příslušného kvanta energie (elektromagnetického záření, tepelné, chemické aj. energie). Molekula je v tomto excitovaném stavu nestabilní a rychle přebytečnou absorbovanou energii ztrácí následným přechodem do základního stavu. Tato deaktivace může probíhat jednak tzv. nezářivými deaktivacemi (přechody), zároveň může být část absorbované energie molekulou vyzářena ve formě elektromagnetického záření, nebo jejich kombinací. Luminiscence je tak emise světla z nějaké látky a nastává při přechodech z prvního excitovaného stavu do stavu základního a to na různou vibrační hladinu. Luminiscence se dělí podle způsobu excitace na:

i.) fotoluminiscenci (excitace elektromagnetickým zářením v UV nebo VIS oblasti)

ii.) elektroluminiscenci (excitace elektrickým polem nebo elektrickým proudem)

iii.) chemiluminiscenci (excitace energií uvolněnou sekundární chemickou reakcí)

iv.) radioluminiscenci (excitace rentgenovým nebo gama zářením)

v.) katodoluminiscenci (excitace elektrony)

vi.) bioluminiscenci (excitace energií uvolněnou oxidací luciferinu za přítomnosti enzymu luciferasy v biologických systémech – rostlina, živočich)

vii.) termoluminiscenci (excitace tepelným zářením

viii.) triboluminiscenci (excitace mechanickou energií, například úderem).

Podle délky tzv. dosvitu (dohasínání) excitovaného záření po ukončení působení absorpce primárního záření dělíme luminiscenci na fluorescenci (doba dosvitu 10¯⁶ – 10¯⁴ s), fosforescenci (10¯³ – 10¯² s) a zpožděnou fluorescenci (> 10¯²s). Fluorescenci pozorujeme během buzení a po jeho vypnutí prakticky ihned mizí (doba dohasínání je obvykle řádově 10¯⁸ s). Fluorescence je tak spinově dovolený zářivý přechod, obvykle z rovnovážné vibrační hladiny stavu S₁ do některé z vibračních hladin základního stavu S₀. U fosforescence se při emisi záření uskutečňuje přechod z excitovaného elektronového stavu na metastabilní hladinu. Fosforescence má delší dobu dohasínání než fluorescence (>>10¯⁸ s) a obvykle ji nelze pozorovat v roztocích při pokojové teplotě. Fosforescence je zářivý přechod z vyššího (T₁) do energeticky nižšího stavu o rozdílné multiplicitě (S₀). Pro zpožděnou fluorescenci je typický zářivý přechod z téhož singletového stavu (S₁) jako při fluorescenci, ale s delší dobou dosvitu, která je dána dobou setrvání molekuly v metastabilním tripletovém stavu. Zpožděná fluorescence je zářivý přechod z téhož singletového stavu (S₁) jako při fluorescenci, ale s delší dobou dohasínání danou časem, po který je molekula v metastabilním tripletovém stavu. Doba dohasínání zpožděné fluorescence je přibližně rovna době dohasínání fosforescence měřené za stejných podmínek. Emisní spektrum zpožděné fluorescence je totožné s emisním spektrem okamžité fluorescence. Metody molekulární fluorescence se stále častěji využívají v biochemickém a biofyzikálním výzkumu, klinické chemii, v genetických analýzách, monitorování životního a pracovního prostředí a dalších oborech.

2 THETA: Schéma energetických přechodů u fluorescence a fosforescence a absorpce energie, b – vibrační relaxace, c – kolizní (nezářivá) de-excitace, d – fluorescence, e - interkombinační konverze (vibračně-rotační de-excitace), f – fosforescence, S₀ – základní stav, S₁ – excitovaný stav, T₁ - tripletový stav, V₀ – V₄ – vibrační hladiny

Mezi analyticky významné luminiscenční metody patří především metody fotoluminiscenční (molekulové fluorimetrie) a chemiluminiscenční.

Mechanismus vzniku fluorescence má tři fáze:

i.) absorpce excitačního záření (valenční elektrony přecházejí ze základního stavu S₀ do stavu energeticky bohatšího čili excitovaného S₁) Absorpční přechod je rychlý (trvá 10¯¹⁵ – 10¯¹⁴ s) a může končit na kterékoliv vibrační hladině příslušného excitovaného stavu;

ii.) nezářivá de-excitace nestabilní excitované molekuly (10¯⁹ – 10¯⁴ s), při které dochází ke ztrátě energie srážkami s dalšími molekulami nebo vnitřní konverzí (vibračně-rotační de-excitace) a přechodu molekuly až na nulové vibrační hladiny prvního excitovaného stavu;

iii.) emise fluorescenčního záření přechodem valenčních elektronů z 1. excitovaného stavu S₁ zpět na různé vibrační hladiny stavu základního S₀, přičemž dochází k vyzáření energie ve formě emitovaného fluorescenčního záření. Díky částečné nezářivé de-excitaci molekuly platí podle Stokesova zákona pro vlnovou délku fotoluminiscenční emise při fotoluminiscenci, že je větší nebo rovna vlnové délce excitačního záření (λemλex). Při Stokesovském buzení fotoluminiscence, kdy frekvence excitačního záření (vex) je větší nebo rovna frekvenci průsečíku emisního a excitačního pásu, nemůže být energetický výtěžek luminiscence větší než 1. Naopak při anti-Stokesovském buzení, kdy je λex menší než frekvence průsečíku emisního a excitačního pásu, energetický výtěžek luminiscence klesá s růstem tohoto rozdílu, a to tím rychleji, čím je nižší teplota.

Mezi hlavní charakteristiky fluorescence patří

i.) intenzita – počet fotonů procházejících v daném směru jednotkovou plochou za jednotku času

ii.) spektrální složení – spektrální hustota fotonového toku na jednotkový interval vlnových délek nebo frekvencí

iii.) doba dohasínání – je dána vnitřní dobou života excitovaného stavu, z něhož dochází k emisi; úzce souvisí s pochody vedoucími k nezářivé deaktivaci tohoto stavu

iv.) polarizace – směr kmitání elektrického vektoru elektromagnetické vlny

v.) koherenční vlastnosti – vztahy mezi fázemi světelných vln.

Každá fluoreskující molekula vykazuje emisní a excitační spektrum, které jsou zrcadlově symetrické. Zrcadlová symetrie mezi absorpčním a fluorescenčním pásem (Obr. níže) platí pro velké množství organických molekul a je způsobena tím, že absorpce i emise z odpovídajících si vibračních hladin mají stejnou relativní pravděpodobnost. Většina absorbujících i emitujících molekul se nachází v rovnovážném vibračním stavu, přičemž vibrační struktura základního i excitovaného stavu mají stejnou strukturu. Po absorpci přechází elektron z rovnovážné vibrační hladiny stavu S₀ na vyšší vibrační hladinu stavu S₁, poté dochází k rychlé vibrační relaxaci na rovnovážnou vibrační hladinu excitovaného stavu S₁ (v čase 10¯¹² - 10¯¹³ s) a teprve poté následuje zářivý přechod na vyšší vibrační hladinu stavu S₀ a další vibrační relaxace na rovnovážnou vibrační hladinu stavu S₀. Rozdílu v energiích mezi maximy absorpčního a emisního pásu se říká Stokesův posuv. Výjimky z pravidla zrcadlové symetrie jsou obvykle důsledkem rozdílného geometrického uspořádání atomových jader v excitovaném stavu oproti uspořádání ve stavu základním.

2 THETA: Zrcadlová symetrie absorpčního (1, 2) a fluorescenčního (emisního, 1´, 2´) spektra rhodaminu 6G při teplotách -60°C (1, 1´) a + 20°C (2, 2´)

Fluorimetrické metody mohou být přímé a nepřímé. Metody přímé využívají vlastní fluorescence analytů (organické látky). Intenzivní fluorescenci vykazují některé aromatické sloučeniny (polyaromatické uhlovodíky nebo heterocykly) nazývané fluorofory nebo fluorescenční barviva, což je využíváno pro jejich stopové a ultrastopové stanovení. Řada i poměrně složitých organických molekul nefluoreskuje, což je významné pro vysokou selektivitu fluorimetrických metod. Charakteristické je teplotní zhášení luminiscence, tj. snižování kvantového výtěžku s teplotou.

Instrumentace

Přístrojové vybavení je obdobné jako u molekulární spektrofotometre a je znázorněno v obr. níže. Zdrojem excitačního záření bývá obvykle xenonová nebo rtuťová výbojka. Jsou zde však vesměs dva monochromátory (jeden pro excitační spektrum a druhý pro emisní spektrum). Pokud je monochromátorem interferenční nebo barevný filtr, pak se jedná o fluorimetr. Naopak spektrofluorimetr obsahuje oba monochromátory s mřížkou nebo hranolem jako dispersním prvkem, spolu s dalšími pomocnými optickými prvky (zrcadlo, štěrbina, čočky aj.). Tok excitačního záření svírá se svazkem emisního záření určitý úhel (obvykle 45° nebo 90°). Absorbujícím prostředím je obvykle křemenná kyveta a detektorem fotonásobič. V některých případech je s výhodou využíváno světlovodů pro zjednodušení optiky, kdy osy obou svazků světlovodů svírají úhel 180°. Vzhledem k tomu, že fluorescenční záření je emitováno ve všech směrech, je často pro zvýšení množství záření dopadajícího na detektor používán tzv. kondenzor ve formě kulového či parabolického zrcadla, které část fluorescenčního záření z úhlů mimo osu detektoru usměrňuje na detektor.

2 THETA - Schéma jednopaprskového spektrofluorimetru (fosforimetru), 1 zdroj excitačního záření (Hg – lampa u fluorimetru, Xe – výbojka u spektrofluorimetru), š – vstupní a výstupní štěrbiny, 2 – excitační monochromátor, 3 – kyveta s měřeným vzorkem, 4 – emisní monochromátor, 5 - detektor

Zdroje
  • [1] Holzbecher Z.: Luminiscenční analýza, ČSAV. Praha 1957
  • [2] Guibauld G. G.: Practical Fluorescence, M. Decker, New York. 1973
  • [3] Pelant I., Valenta J.: Luminiscenční spektroskopie I, Academia Praha 2006.
  • [4] Pelant I., Valenta J.: Luminiscenční spektroskopie II, Academia Praha 2010.
  • [5] Mermet, J-M,, Otto M., Valcárcel M.: Analytical Chemistry: A Modern Approach to Analytical Science. Wiley-VCH,
  • [6] Handbook of Analytical Chemistry. Meites L., Ed., McGraw-Hill, New York. 1963
2 THETA ASE
 

Mohlo by Vás zajímat

Improved LC/MS Performance to Determine Polar Nitrosamines Using the Agilent 1260 Infinity II Hybrid Multisampler

Aplikace
| 2024 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Farmaceutická analýza

SQ Detector 2

Brožury a specifikace
| 2024 | Waters
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Waters
Zaměření
Ostatní

Halogens and sulfur in solid samples according to EN 17813

Aplikace
| 2024 | Metrohm
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Metrohm
Zaměření
Životní prostředí

Determination of carbohydrates in peanuts by HPAE-PAD

Aplikace
| 2024 | Thermo Fisher Scientific
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Thermo Fisher Scientific
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Targeted PFAS Analysis in Industrial Wastewater Using the Agilent 6475 Triple Quadrupole LC/MS System

Aplikace
| 2024 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Životní prostředí
 

Podobné články


Článek | Produkt

Thermo Scientific Stellar - revoluční hmotnostní spektrometr

Thermo Scientific Stellar MS - jedinečné propojení kvadrupólu, iontově koncentračního multipólu a dvojtlaké lineární iontové pasti přináší dosud nevídanou rychlost a přesnost analýz.
Pragolab
more

Článek | Produkt

Přístroje pro extrakci na pevné fázi (SPE)

Extrakce na pevné fázi (SPE) může být použita jak pro čištění, tak i pro zakoncentrování vzorků. Volba přístroje pro SPE významně ovlivňuje kvalitu a spolehlivost analytických výsledků.
Altium International
more

Článek | Zdraví

Patogenní mikroorganismy a Listeria monocytogenes

Patogenní (choroboplodné) mikroorganismy způsobují onemocnění lidí, zvířat nebo rostlin. Změny v Nařízení (ES) č. 2073/2005 platné od 1. 1. 2026.
ALS Czech Republic
more

Článek | Věda a výzkum

Vyvíjíme novou chemii pro pochopení biologie

Čerstvý držitel start-up grantu Athanasios Markos a jeho vývoj chemických nástrojů, které umožní studovat biomolekuly, ale také cíleně ovlivňovat biologické procesy přímo v živých systémech.
Nadace Experientia
more
 

Mohlo by Vás zajímat

Improved LC/MS Performance to Determine Polar Nitrosamines Using the Agilent 1260 Infinity II Hybrid Multisampler

Aplikace
| 2024 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Farmaceutická analýza

SQ Detector 2

Brožury a specifikace
| 2024 | Waters
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Waters
Zaměření
Ostatní

Halogens and sulfur in solid samples according to EN 17813

Aplikace
| 2024 | Metrohm
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Metrohm
Zaměření
Životní prostředí

Determination of carbohydrates in peanuts by HPAE-PAD

Aplikace
| 2024 | Thermo Fisher Scientific
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Thermo Fisher Scientific
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Targeted PFAS Analysis in Industrial Wastewater Using the Agilent 6475 Triple Quadrupole LC/MS System

Aplikace
| 2024 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Životní prostředí
 

Podobné články


Článek | Produkt

Thermo Scientific Stellar - revoluční hmotnostní spektrometr

Thermo Scientific Stellar MS - jedinečné propojení kvadrupólu, iontově koncentračního multipólu a dvojtlaké lineární iontové pasti přináší dosud nevídanou rychlost a přesnost analýz.
Pragolab
more

Článek | Produkt

Přístroje pro extrakci na pevné fázi (SPE)

Extrakce na pevné fázi (SPE) může být použita jak pro čištění, tak i pro zakoncentrování vzorků. Volba přístroje pro SPE významně ovlivňuje kvalitu a spolehlivost analytických výsledků.
Altium International
more

Článek | Zdraví

Patogenní mikroorganismy a Listeria monocytogenes

Patogenní (choroboplodné) mikroorganismy způsobují onemocnění lidí, zvířat nebo rostlin. Změny v Nařízení (ES) č. 2073/2005 platné od 1. 1. 2026.
ALS Czech Republic
more

Článek | Věda a výzkum

Vyvíjíme novou chemii pro pochopení biologie

Čerstvý držitel start-up grantu Athanasios Markos a jeho vývoj chemických nástrojů, které umožní studovat biomolekuly, ale také cíleně ovlivňovat biologické procesy přímo v živých systémech.
Nadace Experientia
more
 

Mohlo by Vás zajímat

Improved LC/MS Performance to Determine Polar Nitrosamines Using the Agilent 1260 Infinity II Hybrid Multisampler

Aplikace
| 2024 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Farmaceutická analýza

SQ Detector 2

Brožury a specifikace
| 2024 | Waters
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Waters
Zaměření
Ostatní

Halogens and sulfur in solid samples according to EN 17813

Aplikace
| 2024 | Metrohm
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Metrohm
Zaměření
Životní prostředí

Determination of carbohydrates in peanuts by HPAE-PAD

Aplikace
| 2024 | Thermo Fisher Scientific
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Thermo Fisher Scientific
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Targeted PFAS Analysis in Industrial Wastewater Using the Agilent 6475 Triple Quadrupole LC/MS System

Aplikace
| 2024 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Životní prostředí
 

Podobné články


Článek | Produkt

Thermo Scientific Stellar - revoluční hmotnostní spektrometr

Thermo Scientific Stellar MS - jedinečné propojení kvadrupólu, iontově koncentračního multipólu a dvojtlaké lineární iontové pasti přináší dosud nevídanou rychlost a přesnost analýz.
Pragolab
more

Článek | Produkt

Přístroje pro extrakci na pevné fázi (SPE)

Extrakce na pevné fázi (SPE) může být použita jak pro čištění, tak i pro zakoncentrování vzorků. Volba přístroje pro SPE významně ovlivňuje kvalitu a spolehlivost analytických výsledků.
Altium International
more

Článek | Zdraví

Patogenní mikroorganismy a Listeria monocytogenes

Patogenní (choroboplodné) mikroorganismy způsobují onemocnění lidí, zvířat nebo rostlin. Změny v Nařízení (ES) č. 2073/2005 platné od 1. 1. 2026.
ALS Czech Republic
more

Článek | Věda a výzkum

Vyvíjíme novou chemii pro pochopení biologie

Čerstvý držitel start-up grantu Athanasios Markos a jeho vývoj chemických nástrojů, které umožní studovat biomolekuly, ale také cíleně ovlivňovat biologické procesy přímo v živých systémech.
Nadace Experientia
more
 

Mohlo by Vás zajímat

Improved LC/MS Performance to Determine Polar Nitrosamines Using the Agilent 1260 Infinity II Hybrid Multisampler

Aplikace
| 2024 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Farmaceutická analýza

SQ Detector 2

Brožury a specifikace
| 2024 | Waters
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Waters
Zaměření
Ostatní

Halogens and sulfur in solid samples according to EN 17813

Aplikace
| 2024 | Metrohm
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Metrohm
Zaměření
Životní prostředí

Determination of carbohydrates in peanuts by HPAE-PAD

Aplikace
| 2024 | Thermo Fisher Scientific
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Thermo Fisher Scientific
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Targeted PFAS Analysis in Industrial Wastewater Using the Agilent 6475 Triple Quadrupole LC/MS System

Aplikace
| 2024 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Životní prostředí
 

Podobné články


Článek | Produkt

Thermo Scientific Stellar - revoluční hmotnostní spektrometr

Thermo Scientific Stellar MS - jedinečné propojení kvadrupólu, iontově koncentračního multipólu a dvojtlaké lineární iontové pasti přináší dosud nevídanou rychlost a přesnost analýz.
Pragolab
more

Článek | Produkt

Přístroje pro extrakci na pevné fázi (SPE)

Extrakce na pevné fázi (SPE) může být použita jak pro čištění, tak i pro zakoncentrování vzorků. Volba přístroje pro SPE významně ovlivňuje kvalitu a spolehlivost analytických výsledků.
Altium International
more

Článek | Zdraví

Patogenní mikroorganismy a Listeria monocytogenes

Patogenní (choroboplodné) mikroorganismy způsobují onemocnění lidí, zvířat nebo rostlin. Změny v Nařízení (ES) č. 2073/2005 platné od 1. 1. 2026.
ALS Czech Republic
more

Článek | Věda a výzkum

Vyvíjíme novou chemii pro pochopení biologie

Čerstvý držitel start-up grantu Athanasios Markos a jeho vývoj chemických nástrojů, které umožní studovat biomolekuly, ale také cíleně ovlivňovat biologické procesy přímo v živých systémech.
Nadace Experientia
more
Další projekty
Sledujte nás
Další informace
WebinářeO násKontaktujte násPodmínky užití
LabRulez s.r.o. Všechna práva vyhrazena. Obsah dostupný pod licencí CC BY-SA 4.0 Uveďte původ-Zachovejte licenci.