Organická analýza - Elektroseparační metody (EKC)

8 ELEKTROSEPARAČNÍ METODY

8.4 Elektrokinetické chromatografické metody

• 8.4.1 Micelární elektrokinetická chromatografie
  • 8.4.1.1 Tenzidy používané v micelární elektorkietické chromatografii
• 8.4.2 Další elektrokinetické chromatografické techniky
• 8.4.3 Instrumentální aspekty spojené s elektrokinetickou chromatografií
• 8.4.4 Aplikace elektrokinetické chromatografie

Kniha obsahuje přehled metod analýzy organických látek: Analytikům prohloubí jejich znalosti používaných metod a vedoucím pracovníkům poskytne podklady pro řešení úkolů jejich laboratoře. Je určena také pro studenty a vyučující univerzit a vědecké pracovníky.

💡 Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci Organická analýza, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.

ELEKTROSEPARAČNÍ METODY

Elektrokinetická chromatografie (EKC) patří mezi skupinu elektromigračních separačních technik, které využívají k separaci kombinaci dvou elektrokinetických jevů – elektroforézy a elektroosmózy. Na rozdíl od nejběžnější techniky kapilární zónové elektroforézy, která byla detailně popsána v kapitole 8.1, zahrnuje separace pomocí EKC také chemickou rovnováhu (rozdělovací rovnováhu, výměnu iontů nebo tvorbu komplexů). K vytvoření chemické rovnováhy jsou použita vhodná aditiva do základního elektrolytu, která jsou označována jako tzv. pseudostacionární fáze a zpravidla se jedná o molekuly, nebo molekulární útvary (micely, mikroemulze) nesoucí náboj. Na rozdíl od kapilární zónové elektroforézy je aplikační potenciál EKC rozšířen pomocí interakce s pseudostacionární fází i na separaci neutrálních analytů, které nemají vlastní efektivní pohyblivost v elektrickém poli. V dalším textu budou diskutovány pouze případy separace neutrálních analytů.

Termín elektrokinetická chromatografie byl poprvé použit v souvislosti s nejběžnějším módem EKC – micelární elektrokinetickou chromatografií (MEKC) [1,2]. Princip MEKC je podrobně popsán v podkapitole knihy. Uvedené práce naznačily souvislost mezi EKC a kapalinovou chromatografií, kdy na separační princip EKC lze nahlížet jako na speciální případ chromatografie s elektroosmoticky čerpanou mobilní fází a pohyblivou pseudostacionární fází. Při popisu separace se také na rozdíl od ostatních módů kapilární elektroforézy využívá terminologie převzatá z kapalinové chromatografie.

Grafické vyjádření rychlostí při jednotlivých módech EKC je zobrazeno na obr. níže. Z výše uvedených vztahů vyplývá, že volba pseudostacionární fáze hraje klíčovou roli při návrhu a optimalizaci separace pomocí EKC.

2 THETA: Eluční módy v elektrokinetické chromatografii. veo – migrační rychlost elektroosmotického toku, vps – migrační rychlost pseudostacionární fáze, va – rychlost pohybu analytu.

Při separaci pomocí EKC je možné využít všech typů interakcí, které jsou známé z kapalinové chromatografie včetně hydrofobních interakcí, van der Waalsových sil, elektrostatických interakcí, tvorby koordinačních vazeb apod. V literatuře je možné nalézt velké množství konkrétních aplikací EKC, jejichž přehled podle použité pseudostacionární fáze a označení je uveden v tabulce níže.

2 THETA: Tabulka: Přehled typů elektrokinetické chromatografie

Micelární elektrokinetická chromatografie

Nejstarší a nejpoužívanější technika EKC je micelární elektrokinetická chromatografie. Tato technika byla vyvinuta v druhé polovině osmdesátých let minulého století pro separaci neutrálních látek [1,4]. Při MEKC se jako pseudostacionární fáze používá vhodný tenzid, který se přidává do základního elektrolytu v koncentracích vyšších než tzv. kritická micelární koncentrace. Analyzované látky se rozdělují mezi micelární a vodnou fázi, přičemž polárnější látky setrvávají delší dobu ve vodné fázi, látky méně polární jsou více vázány v micelách. Velmi polární látky, které se nerozdělují do micel a setrvávají jen ve vodné fázi (methanol, formamid, aceton, thiomočovina apod.) jsou unášeny pouze elektroosmotickým tokem. Opačným extrémem jsou vysoce hydrofobní látky, které se váží pouze do micel. Pro stanovení migračního času micel ve vodných základních elektrolytech se používají ve vodě nerozpustná organická barviva (např. Sudan III – 1-[(4-fenylazo)fenylazo]-2-naftol) nebo další hydrofobní organické látky (např. anthracen, dodekanofenon). Ostatní analyty se budou pohybovat mezi těmito dvěma krajními mezemi a retenční/migrační časy budou záviset na jejich rozdělovacím koeficientu mezi vodnou a micelární fází.

TENZIDY POUŽÍVANÉ V MICELÁRNÍ ELEKTROKINETICKÉ CHROMATOGRAFII

Tenzidy jsou sloučeniny amfifilního charakteru obsahující hydrofobní část (např. alkylový řetězec) a hydrofilní část (ionizovatelná funkční skupina, např. sulfonová skupina –SO₃H). Při koncentraci vyšší než tzv. kritická micelární koncentrace (CMC) se molekuly tenzidu shlukují do micel, orientovány ve vodném prostředí hydrofobními řetězci dovnitř micely a hydrofilní částí do okolního roztoku. Vznik micely je tedy důsledkem hydrofobního odpuzování mezi uhlíkovými řetězci tenzidů a vodným prostředím, dále jsou výsledkem odpuzování nábojů polárních konců a také výsledkem van der Waalsových přitažlivých sil mezi uhlíkovými řetězci uvnitř micely [6]. Při tvorbě micel jsou makroskopické vlastnosti micelárního roztoku stejné, jako vlastnosti pravého roztoku vzhledem k malým rozměrům micel (jednotky nanometrů). Micely mohou získat povrchový náboj, skládající se z příspěvků jednotlivých molekul tenzidu, v jehož důsledku mohou mít vlastní elektroforetickou pohyblivost. Vnitřní hydrofobní část micely představuje vhodné prostředí pro interakce s neutrálními molekulami analytů.

V MEKC se jako pseudostacionární fáze využívají aniontové i kationtové tenzidy, případně směsné micely iontových tenzidů s neutrálními. Přehled nejběžnějších používaných tenzidů v MEKC je uveden v tabulce výše spolu s hodnotami CMC tenzidů ve vodě. Průměrný počet molekul tenzidu obsažených v micelách je popsán tzv. agregačním číslem. Krafftova teplota (kritická micelární teplota) pak udává teplotu, při níž je rozpustnost tenzidu právě rovna CMC. Pod touto teplotou tedy tenzidy netvoří micely a jejich rozpustnost je velmi malá. Se vznikem micel souvisí změna celé řady fyzikálně-chemických vlastností, kterých se využívá při stanovení CMC. Mezi tyto vlastnosti patří povrchové napětí, vodivost (v případě iontových tenzidů), osmotický tlak, viskozita, hustota a turbidita. Přímo v elektroforetickém systému je možné provést stanovení CMC tenzidu v použitém základním elektrolytu měřením efektivních pohyblivostí neutrálních látek [7], nebo měřením proudu protékajícího kapilárou v závislosti na koncentraci tenzidu v základním elektrolytu [8]. Příklad závislosti pohyblivostí homologické řady alkylbenzenů (metyl- až butylbenzen) a proudu na koncentraci dodecylsíranu sodného v borátovém základním elektrolytu je uveden na obr. níže.

2 THETA: Stanovení kritické micelární koncentrace dodecylsíranu sodného metodou založenou na pohyblivosti alkylbenzenů (A) a na hodnotě proudu procházejícího separační kapilárou (B) v závislosti na koncentraci tenzidu v elektrolytu. Šipka označuje hodnotu CMC. BGE 25 mmol.l¯¹ boritanový pufru o pH 9,3, napětí 20 kV, křemenná kapilára 40 (32) cm x 50 μm [9].

Nejčastěji používanými typy tenzidů v MEKC jsou alkylsírany sodné, přičemž dodecylsíran sodný (laurylsíran sodný, SDS) má obdobné postavení jako oktadecylsilikagelová kolona v kapalinové chromatografii. Kritická micelární koncentrace v homologické řadě alkylsíranů klesá s počtem uhlíků v alkylu, ale zároveň stoupá Krafftova teplota. V porovnání s vodným prostředním CMC klesá se zvyšující se iontovou silou roztoku. V běžně používaných základních elektrolytech je pro SDS uváděna hodnota CMC v rozmezí 2,6-5 mmol.l¯¹ [10].

2 THETA: Nejběžnější tenzidy používané v micelární elektrokinetické chromatografii.

Další elektrokinetické chromatografické technik

Přestože je micelární elektrokinetická chromatografie nejvíce využívanou technikou z elektrokinetických chromatografických technik, v určitých případech může být výhodnější použití jiné techniky (viz. tabulka Přehled typů elektrokinetické chromatografie). Speciální aplikací MEKC je mikroemulzní elektrokinetická chromatografie (MEEKC) [15-18]. Jako pseudostacionární fáze jsou v MEEKC použity micely s přídavkem dalších podpůrných sloučenin. Tyto tzv. mikroemulze jsou tvořeny micelami, jejichž jádro sestává z mikroskopické kapky lipofilního organického rozpouštědla (n-heptan, n-oktan, diethylether, cyklohexan apod.) a je stabilizováno alifatickým alkoholem s krátkým řetězcem, např. 1-butanolem (obr. níže). Mikroemulze jsou obecně větší než micely (10-50 nm ve srovnání s 3-6 nm průměru micel), což přináší výhodu zejména v možnosti dávkovat větší množství vzorku.

2 THETA: Schéma mikroemulze.

Instrumentální aspekty spojené s elektrokinetickou chromatografií

Vzhledem k tomu, že EKC techniky vycházejí ve svém principu z kapilární zónové elektroforézy, lze je provozovat s použitím stejné instrumentace. Tato instrumentace byla detailněji popsána v předchozích kapitolách věnovaných elektromigračním separačním technikám, a proto budou v následujícím textu zmíněny pouze ty aspekty, při kterých existují podstatné rozdíly od ostatních módů kapilární elektroforézy. Přítomnost iontových tenzidů v základním elektrolytu vede ke zvýšené vodivosti roztoku, a tedy k průchodu vyššího proudu separační kapilárou. V MEKC při běžných koncentracích tenzidů do trojnásobku CMC většinou nepřekračují dosažené hodnoty proudu limitů komerční instrumentace (zpravidla 200-250 μA při vloženém napětí do 30 kV). Při výkonu větším než 1 W na metr separační kapiláry však může docházet k podstatnému rozšiřování zón separovaných látek, a tedy ke snížení separační účinnosti. Z tohoto hlediska je tedy výhodné používat pseudostacionární fáze v co nejnižší koncentraci.

V EKC je v některých případech výhodné eliminovat elektroosmotický tok uvnitř křemenných separačních kapilár, případně omezit sorpci analyzovaných látek na vnitřní povrch kapiláry. Tuto úpravu je možné provést pomocí tzv. dynamického pokrytí vhodným činidlem, nebo stabilněji chemickou modifikací separační kapiláry. Pokrývající materiál, nejčastěji neutrální polymer, je na kapilární stěnu navázán reakcí se silanolovými skupinami. Pro chemickou modifikaci jsou používané polyakrylamid, methylcelulosa, hydroxypolyether, polyethylenglykol, polyvinylpyrrolidon a další polymery. Prvním krokem v přípravě modifikovaných kapilár je preparace povrchu bifunkčním činidlem. Silanolové skupiny reagují s organokřemičitým činidlem, obsahujícím v molekule vinylovou skupinu (např. γ-metakryloxypropyl-trimethoxysilan). V následujícím kroku se kapilára naplní polymerujícím roztokem obsahujícím vhodný monomer a iniciátor polymerace (obr. níže). Polymerující řetězce se adují na vinylové skupiny na stěně kapiláry, čímž dochází k jejímu kovalentnímu pokrytí. Pokryté kapiláry vykazují většinou výrazně odlišnou charakteristiku elektroosmotického toku v porovnání s nepokrytou křemennou kapilárou. Posledním krokem po polymeraci je mechanické vytlačení nenavázaného polymeru z kapiláry a stanovení velikosti zbytkového elektroosmotického toku. Hydrolyticky odolnější pokrytí kapilár je možné vytvořit přímou vazbou křemík-uhlík pomocí Grignardovy reakce a následné polymerace [31].

2 THETA: Modifikace povrchu kapiláry kovalentním navázáním lineárního polyakrylamidu [32].

Aplikace elektrokinetické chromatografie

Od svého uvedení v osmdesátých letech minulého století nalezly elektrokinetické chromatografické techniky uplatnění v analýze širokého spektra látek jak biogenního, tak umělého původu. Zatímco MEKC je v normálním elučním módu vhodnější spíše pro látky polárnější, v obráceném módu s redukovaným elektroosmotickým tokem se hodí pro látky méně polární a MEEKC či další typy elektrokinetické chromatografie jsou téměř univerzálními technikami.

2 THETA: Separace herbicidů pomocí MEKC v 25 mmol.l¯¹ boritanovém pufru pH 9,3 s přídavkem 17,5 mmol.l¯¹ tetradecylsíranu sodného a 20 % (v/v) acetonitrilu.

Pomocí MEKC byly vypracovány metody pro analýzy a stanovení různých derivátů aminokyselin [34,35], při použití detekce pomocí optimalizované laserem indukované fluorescence je uváděno minimální detekovatelné množství 40-400 amol dávkovaného derivátu [36]. Dále byly separovány peptidy a proteiny [37,38], různá léčiva jako barbituráty, antibiotika, steroidy, analgetika, antipyretika a mnoho dalších. Z čistě organických sloučenin analyzovaných pomocí MEKC je možno uvést např. fenoly a chlorfenoly [1,39], nitrolátky obsažené v explozivech a střelných praších [40], polyaromatické uhlovodíky s použitím žlučových kyselin jako micelární fáze [41] nebo močovinové a triazinové herbicidy [42]. Na obrázcích níže jsou uvedeny ukázky separací herbicidů a přírodních antioxidantů pomocí MEKC.

2 THETA: Separace fenolických kyselin a flavonoidů pomocí MEKC v 25 mmol.l¯¹ boritanovém pufru pH 9,3 s přídavkem 36 mmol.l¯¹ decylsíranu sodného.

Aplikace MEEKC je soustředěna na separace špatně rozpustných neutrálních sloučenin jako jsou vitaminy rozpustné v tucích [43], steroidy [44] nebo polyaromatické uhlovodíky [45]. Další oblastí aplikací MEEKC je separace a stanovení látek ve farmaceutických přípravcích [46,47]. MEEKC může být rovněž použita k analýze agrochemikálií, např. močovinových a triazinových herbicidů. Další významnou aplikací je měření a výpočet rozpustnosti (rozdělovacích koeficientů) neutrálních, kyselých i bazických látek [48,49]. Možnosti a aplikace dalších typů elektrokinetických chromatografických technik spočívají zejména v analýze optických, polohových a stereoizomerů a obdobně jako uvedené metody v analýze hydrofobních látek.