Organická analýza - Hmotnostní spektrometrie (Tandemová, Mobilní, IRMS)

6 HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE

6.3 Tandemová hmotnostní spektrometrie

• 6.3.1 Tandemové hmotnostní spektrometry na bázi sektorových analyzátorů
• 6.3.2 Trojitý kvadrupól (QQQ, QqQ)
• 6.3.3 Tandem TOF-TOF
• 6.3.4 Trojitý kvadrupól s lineární iontovou pastí (QqQLIT)
• 6.3.5 Q-TOF

6.4 Mobilní hmotnostní spektrometrie

6.5 Hmotnostní spektrometrie izotopových poměrů (IRMS)

• 6.5.1 Princip IRMS
• 6.5.2 Využití IRMS

Kniha obsahuje přehled metod analýzy organických látek: Analytikům prohloubí jejich znalosti používaných metod a vedoucím pracovníkům poskytne podklady pro řešení úkolů jejich laboratoře. Je určena také pro studenty a vyučující univerzit a vědecké pracovníky.

💡 Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci Organická analýza, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.

Tandemová hmotnostní spektrometrie

Principem tandemové hmotnostní spektrometrie je izolace zvoleného iontu (tzv. prekurzoru, dříve rodičovského iontu) v prvním stupni, vyvolání jeho fragmentace dodáním energie v reakční oblasti a registrace produktového (dříve dceřiného) hmotnostního spektra. Toto spektrum se vztahuje pouze ke zvolenému prekurzoru, může tedy přispět k objasnění jeho struktury. Tandemová hmotnostní spektrometrie se začala rozvíjet od počátku 60. let minulého století v souvislosti se zkoumáním tzv. metastabilních iontů (tj. iontů, které se rozpadají během letu hmotnostním spektrometrem), jejichž zastoupení bylo uměle zvyšováno kolizemi s inertním plynem cíleně přiváděným do určité oblasti hmotnostního spektrometru. Za zakládající publikací této disciplíny je považována kniha R.G. Cookse a kol. „Metastable Ions“ z roku 1973 [39]. Základní tři kroky tandemové hmotnostní spektrometrie se mohou odehrávat buď v prostoru (ionty prolétávají určenou trajektorii, jednotlivé kroky probíhají simultánně), nebo v čase (ionty zůstávají ve stejném místě, jednotlivé kroky probíhají v časové posloupnosti). Do první skupiny patří přístroje využívající sektorových analyzátorů, kvadrupólů a průletových analyzátorů, do druhé pak analyzátory uchovávající ionty – iontové pasti. a iontová cyklotronová rezonance. Hybridní systémy pak využívají současně analyzátory z obou skupin.

V MS/MS se využívají čtyři základní experimenty:

• Sken produktů (Product scan)
• Sken prekurzorů (Precursor Scan)
• Sken konstantní neutrální ztráty (Constant Neutral Loss Scan)
• Sledování vybrané fragmentace / vybraných fragmentací (MRM – Multiple Reaction Monitoring)

Tandemové hmotnostní spektrometry na bázi sektorových analyzátorů

První experimenty s tandemovou hmotnostní spektrometrií byly prováděny na dvousektorových analyzátorech s obrácenou geometrií (BE). Tato technika se označuje jako MIKES (Mass-analyzed Ion Kinetic Energy Spectrometry).

Trojitý kvadrupól (QQQ, QqQ)

Trojitý kvadrupól je využíván v tandemové hmotnostně spektrometrické analýze organických sloučenin již od roku 1979 [41]. Klíčem k jeho využití byl objev možnosti kolizně indukované disociace iontů v kvadrupolu operovaném v Rf-only modu [42]. Schéma tohoto uspořádání je na Obrázku níže. První kvadrupól Q1 nejčastěji slouží k výběru prekurzoru – iontu, který má být podrobněji studován, druhý Q2 slouží jako kolizní cela, do které je přiváděn terčový plyn (nejčastěji Ar nebo N₂) a dochází zde ke kolizně indukované disociaci (srážky iontů a neutrálních molekul terčového plynu vyvolávají fragmentaci iontů). Poslední Q3 pak provádí skenování produktů nebo sleduje pouze vybraný fragment charakteristický pro analyzovanou sloučeninu.

2 THETA: Trojitý kvadrupól

Trojitý kvadrupól je velmi oblíben ve spojení s chromatografickými separačními technikami. Zejména v modu MRM umožňuje dosažení velice dobrých mezí detekce.

Tandem TOF-TOF

Dva průletové analyzátory za sebou našly svoje uplatnění zejména ve spojení s ionizační technikou MALDI. První analyzátor fungující v lineárním modu slouží k výběru prekurzoru, který je iontovou bránou vpuštěn do kolizní cely a odtud do druhého analyzátoru s reflektronem. Tyto systémy našly svoje uplatnění zejména v proteomice při sekvenování biopolymerů. Vyznačují se naprosto minimálními nároky na množství vzorku – k měření postačí attomoly analyzované substance.

Trojitý kvadrupól s lineární iontovou pastí (QqQLIT)

Tento hybridní analyzátor je v podstatě trojitým kvadrupólem, kde namísto třetího kvadrupólu je lineární iontová past. Tento systém může fungovat jako plnohodnotný trojitý kvadrupól, s využitím možností lineární iontové pasti je možno provádět i MS³ . Systémy tohoto typu nacházejí svoje uplatnění v proteomice, analýze životního prostředí, kontrole potravin a v dalších aplikacích.

Q-TOF

Tento systém opět vychází z trojitého kvadrupólu, kde třetí kvadrupól je nahrazen ortogonálně zařazeným analyzátorem doby letu. První a druhý kvadrupól fungují standardním způsobem, ionty vycházející z kolizní cely jsou pulsní elektrodou s nastavenou frekvencí vystřelovány v kolmém směru do průletového analyzátoru s jedním reflektronem (V-trajektorie), případně dvěma (W-trajektorie). Oproti trojitému kvadrupólu tento systém umožňuje analýzu produktů s vysokým rozlišením, díky vlastnostem analyzátoru TOF je možno registrovat plná produktová spektra s citlivostí charakteristickou pro MRM mód trojitého kvadrupólu. Tyto systémy nacházejí uplatnění v metabolomice, proteomice, biofarmaceutickém a farmaceutickém výzkumu, při kontrole bezpečnosti potravin, v toxikologii, v kriminalistice i v dalších oblastech.

Mobilní hmotnostní spektrometrie

Miniaturizace našla svoje uplatnění i v oblasti hmotnostní spektrometrie, díky čemuž lze dnes využít tuto techniku i přímo v místě odběru vzorku. Jako příklad lze uvést přístroj MX908 firmy 908devices (Boston, Ma, USA), jehož hmotnost (4,3 kg) i malé rozměry dovolují držet jej v rukách. Přístroj využívá elektronové ionizace a miniaturní sférické iontové pasti operované za horšího vakua, než je ve standardních analyzátorech (tzv. HPMS – High Pressure Mass Spectrometry), a je napájen z baterií. Po zapnutí je přístroj připraven k měření zhruba za 1 minutu. Přístroj může analyzovat pevné, kapalné i plynné vzorky včetně aerosolů. Jeho ovládání je mimořádně jednoduché a díky vestavěné knihovně hmotnostních spekter je možno spolehlivě identifikovat celou řadu sloučenin ze skupiny výbušnin, bojových chemických látek, drog a nebezpečných chemikálií, a to na koncentrační hladině podstatně nižší než u FTIR nebo Ramanovy spektrometrie [43].

2 THETA: Přenosný hmotnostní spektrometr MX908

Hmotnostní spektrometrie izotopových poměrů (IRMS)

Princip IRMS

Princip IRMS Hmotnostní spektrometrie izotopových poměrů (IRMS, Isotope Ratio Mass Spectrometry), někdy označovaná též jako izotopová poměrová hmotnostní spektrometrie, se zabývá sledováním poměrů stabilních izotopů vybraných prvků. U organických sloučenin jsou nejčastěji analyzovány izotopy uhlíku (¹³C/¹²C), kyslíku (¹⁸O/¹⁶O), dusíku (¹⁵N/¹⁴N), vodíku (D/H) a síry (³⁴S/³²S). Princip metody je relativně jednoduchý: Analyzované vzorky se převádějí do formy jednoduchých plynných sloučenin (CO₂ pro uhlík, CO pro kyslík, N₂ pro dusík, H₂ pro vodík, SO₂ pro síru), které jsou vedeny do hmotnostního spektrometru s elektronovou ionizací, magnetickým analyzátorem a několika (nejčastěji třemi nebo pěti) Faradayovými detektory. Schéma přístroje je uvedeno na níže.

2 THETA: Schéma hmotnostního spektrometru izotopových poměrů

K převedení vzorku na jednoduché plynné sloučeniny lze využít řady metod v závislosti na skupenství vzorku. Pro pevné vzorky se využívá elementární analyzátor, který spalováním v proudu kyslíku, následnou redukcí oxidů dusíku a záchytem vodních par produkuje CO₂ a N₂, nebo vysokoteplotní pyrolýzou vzniká CO. Kapalné vzorky mohou být dávkovány do elementárního analyzátoru pomocí dávkovače kapalin, případně uzavřené ve speciálních kapslích; další postup je stejný jako u pevných vzorků. Alternativní možností je rozklad kapalného vzorku koncentrovanou kyselinou fosforečnou, oxidace peroxodisíranem a převod plynných produktů do hmotnostního spektrometru. V případě potřeby separace složek vzorku je možno využít kapalinové chromatografie a do rozkladného zařízení pak převést pouze vybraný pík. Plynné vzorky mohou být dávkovány do hmotnostního spektrometru přes zařízení umožňující stanovení izotopického složení CO₂ a N₂O, případně i CH₄ po jeho spálení. Další možností je plynově chromatografická separace následovaná přenosem vybraných píků do spalovacího zařízení, vysušení spalin a analýza vzniklého CO₂ a N₂ v hmotnostním spektrometru.

Výstupy z hmotnostního spektrometru izotopových poměrů jsou hodnoty relativní; primárním údajem je poměr četnosti iontu obsahujícího minoritní (zpravidla těžší) izotop k četnosti iontu obsahujícího majoritní (zpravidla lehčí) izotop - např. pro izotopickou analýzu uhlíku se registruje ion m/z 44 (¹²C ¹⁶O₂) a 45 (¹³C ¹⁶O₂); za účelem korekce signálu m/z 45 na příspěvek ¹²C ¹⁷O ¹⁶O se sleduje rovněž intenzita signálu m/ z 46 (¹²C ¹⁸O ¹⁶O), k níž ovšem malou měrou přispívá i ¹³C ¹⁷O ¹⁶O.

Využití IRMS

Zdrojem informace získávaného pomocí IRMS jsou procesy označované jako izotopická frakcionace, ke kterým v přírodě dochází v rámci přirozených koloběhů sledovaných prvků. Izotopy vykazují v podstatě stejné chemické vlastnosti, neboť ty jsou určovány počtem elektronů ve valenčních sférách (jistý rozdíl je v reakční kinetice – mírně rychleji reagují molekuly s lehčími izotopy, a rovněž vazby tvořené těžšími izotopy jsou pevnější). Rozdíl v atomové hmotnosti izotopů (a potažmo i sloučenin je obsahujících) je příčinou rozdílů v jejich fyzikálních vlastnostech, které pak vedou k izotopické frakcionaci.