24. Škola MS 2023 - den 4

První sekce 4. dne byla zaměřena na MS aplikace v metabolomice a lipidomice. Které metabolity jsou důležité při srdečním selhání? Trendy v profilování rostlinných hormonů nebo klinické lipidomice a na závěr přednáška zaměřena na využití MS v analýze mastných kyselin.

Životní prostředí a analýza potravin jsou již tradiční obory pro které je hmotnostní spektrometrie zásadním nástrojem pro kvalitativní a kvantitavní analýzu na stopových úrovních. Jak se dívat cíleně nebo necíleně na vodu? Kontaminace životního prostředí a její vliv na naše zdraví - biomonitoring. Potraviny musí být kvalitní, pravé/nefalšované a také bezpečné - MS jako silný nástroj v jejich analýze.

Třetí sekce se zaměřila na zobrazovací hmotnostní spektrometrii a analýzu povrchů. Co jej to SIMS? Využití TOF-SIMS/MS v analýze širokého spektra vzorků. Jak vizualizovat proteiny a jaké použití má laserová ablace ve spojení s ICP-MS? Závěrečná přednáška sa zaměřila na jednu ze základních zobrazovacích MS technik - MALDI.

Poslední sekce již přinesla 6 kratších přednášek našich mladých a nadějných analytických chemiků s tématy jako proteomika, lipidomika, metabolomika, ASAP-MS, HILIC/MS nebo IR-LA + SP-ICP/MS.

Odborný program uzavřela dvojice přednášek pod hlavičkou společnosti Shimadzu zaměřených na Využití a automatizaci LC MS/MS v klinických laboratořích.

• 💾 On-line: Program 24. ročník Školy hmotnostní spektrometrie

• 💾 PDF: Program 24. ročník Školy hmotnostní spektrometrie

• 💾 PDF: Abstrakty přednášek v sekci Mládí vpřed a plakátových sdělení

ČTVRTEK

SEKCE IX. APLIKACE V METABOLOMICE A LIPIDOMICE

• Předsedající: Roman Grabic

8:30 - 9:00 Důležité metabolity při srdečním selhání

• Ondřej Kuda

SSJMM: Důležité metabolity při srdečním selhání (Ondřej Kuda)

9:00 - 9:30 Nedávné pokroky v profilování rostlinných hormonů

• Ondřej Novák

9:30 - 10:00 Perspektivy a aplikace klinické lipidomiky

• Aleš Kvasnička

SSJMM: Perspektivy a aplikace klinické lipidomiky (Aleš Kvasnička)

10:00 - 10:30 The challenge of isomers: Mass spectrometry for the discovery of fatty acids (virtuální přednáška)

• Philipp Menzel

10:30 - 11:00 PŘESTÁVKA NA KÁVU

SEKCE X. APLIKACE V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ A POTRAVINÁŘSTVÍ

• Předsedající: Ondřej Novák

11:00 - 11:30 Necílená a cílená analýza ve vodách

• Roman Grabic

11:30 - 12:00 Využití MS pro analýzu organických látek v životním prostředí a v biomonitoringu

• Petr Kukučka

12:00 - 12:30 Využití MS při hodnocení kvality, autenticity a bezpečnosti potravin

• Jana Pulkrabová

SSJMM: Partneři 24. Školy hmotnostní spektrometrie 2023

12:30 - 14:00 OBĚD

13:00 - 13:45 PLAKÁTOVÁ SDĚLENÍ – SUDÁ ČÍSLA

SEKCE XI. ANALÝZA POVRCHŮ A ZOBRAZOVACÍ MS

• Předsedající: Jan Preisler

14:00 - 14:30 Úvod do hmotnostní spektrometrie sekundárních iontů (SIMS)

• Jan Lorinčík

14:30 - 15:00 TOF-SIMS/MS - a hybrid solution for the analysis and imaging of a wide range of samples

• Matthias Kleine-Boymann

15:00 - 15:30 Vizualizace proteinů: Nástroje se schopností rozpoznávání molekul + LA-ICP-MS

• Tomáš Vaculovič

15:30 - 16:00 MALDI zobrazovací hmotnostní spektrometrie

• Lukáš Kučera

16:00 - 16:30 PŘESTÁVKA NA KÁVU

SEKCE XII. MLÁDÍ VPŘED

• Sponzorem je společnost Pragolab
• Předsedající: Aleš Kvasnička

16:30 - 16:45 Focusing on membrane peptides in standard proteomic workflows

• Jana Březinová

What is the main cause of poor membrane peptide identifications in bottom-up proteomics? There are many reasons why analysis of membrane protein segments using mass spectrometry is laborious. First, protein digestion is usually performed in aqueous buffers where hydrophobic membrane proteins/peptides might precipitate or adhere to plastic surfaces. Second, hydrophobic membrane regions often contain less trypsin cleavage sites which leads to generating long peptides. This could be overcome by employing different digestion techniques. However, small number of basic residues harbouring positive charge in electrospray ionization make lower charge states more prominent. Additionally, singly charged ions are often not targeted in standard proteomic approaches. The combination of all effects can limit membrane peptide detection in typical proteomic MS experiment. By fine tuning already available sample preparation techniques and developing a new LC-MS/MS method we were able to overcome some sources of poor membrane peptide identifications. By not limiting our scope we compared membrane protein and peptide identification in our standard workflow - enhanced filter aided sample preparation (eFASP) with a newer filter-less solid-phase-enhanced sample preparation protocol SP3 now widely used.

Contrary to the general belief eFASP enabled more membrane protein/peptide identifications for standard sample amounts (50-100 ug of proteins). eFASP was therefore further modified and additional fractions generated by the workflow collected. Filter washes became valuable source of membrane peptides and together with chymotrypsin digestion more membrane proteins and peptides were identified. Further improvements are being tested which include analysis of ethyl acetate fraction generated by final liquid-liquid extraction of peptides during eFASP to remove deoxycholic acid as detergent and modifications on liquid chromatography conditions.

16:45 - 17:00 Separace sfingolipidů a rozlišování jejich isomerních tříd v plazmě a buněčných liniích pomocí HILIC/MS

• Denisa Kolářová

Lipidy jsou biologicky aktivní látky, které se nacházejí ve všech eukaryotických buňkách a hrají významnou roli v buněčné signalizaci, tvorbě membrán a mechanismech ukládání energie. Soubor lipidů uvnitř buňky se nazývá lipidom a zahrnuje tisíce jednotlivých lipidů. Dysregulace lipidů může souviset se závažnými onemocněními, jako je například rakovina. Sfingolipidy (SP) jsou běžně detekovány v lipidových extraktech z biologických vzorků. Tyto lipidy se obvykle nacházejí v buněčných membránách, což jsou mechanicky stabilní a chemicky rezistentní dvojvrstvy složené převážně z fosfolipidů a okolních prokaryotických nebo eukaryotických buněk. V současné době je zaznamenána alterace metabolismu SP u pacientů s nádorovými onemocněními, což vede k rostoucí popularitě jejich analýzy. Primární technikou analýzy lipidů je hmotnostní spektrometrie, která ve spojení se separačními metodami umožňuje stanovení velkého počtu lipidů z různých lipidových kategorií.

V rámci naší práce byla vyvinuta HILIC/MS metoda pro identifikaci a kvantifikaci rozmanitého spektra SP ve vzorcích lidské plazmy a buněčných liniích. Z lidské plazmy byly SP izolovány a extrahovány pomocí směsi ethanol-voda, následované čištěním na C18 kolonkách s pevnou fází, z buněčných linií podle modifikovaného Folchova postupu, kde byla oddělována organická fáze. Pro optimalizaci chromatografických podmínek jsme zohlednili výběr kolony, složení mobilních fází, gradient, průtok mobilních fází a koncentraci pufru, abychom dosáhli nejlepšího možného chromatografického rozlišení. Nejvyšší rozlišení bylo dosaženo pomocí kolony Acquity UPLC BEH HILIC (150 x 2.1 mm; 1.7 μm). Zvláštní důraz byl kladen na rozlišení izomerních tříd, jako například glukosylceramidy od galaktosylceramidů a laktosylceramidy od digalaktosylceramidů. Díky optimalizované metodě jsme byli schopni identifikovat více než 100 sfingolipidů z 11 lipidových tříd v plazmě i buněčných liniích. Identifikace byla založena na jejich retenčním čase, vysoké přesnosti hmotnosti a fragmentačním chování pomocí MS/MS. Pro více polární sfingolipidy, konkrétně gangliosidy, byla modifikována a optimalizována další HILIC/MS metoda. Tyto lipidy byly izolovány a extrahovány z buněčných linií podle Folchova postupu a byla odebírána vodná fáze. Bylo identifikováno 15 lipidových podtříd gangliosidů.

17:00 - 17:15 Přímá analýza pylových zrn s využitím modifikované ASAP-MS techniky

• Petra Krejčí

Mikroskopická analýza je běžně využívaným nástrojem pro identifikaci pylových zrn, kde jsou jednotlivé druhy pylových zrn identifikovány na základě jejich morfologie bez znalosti chemického složení pylového zrna. Za účelem studia chemického složení pylových zrn je nejčastěji využíváno spojení plynové chromatografie s hmotnostní spektrometrií (GC/MS). Doposud však nebyla realizována studie, která by se zabývala analýzou taxonomicky odlišných druhů pylových zrn se zaměřením na jejich chemickou odlišnost. Navíc využívané GC/MS přístupy vyžadují extrakci analytů z pylových zrn do kapalné fáze, což může vést k diskriminaci některých analytů na základě použitých extrakčních rozpouštědel.

Tento příspěvek se zabývá studiem chemického složení vybraných druhů pylových zrn zvolených na základě taxonomické odlišnosti/příbuznosti, zbarvení a vzhledu povrchu. Pro účely rychlé a přímé analýzy pylových zrn byla modifikována kapilára pro hmotnostní spektrometrii s přímou sondou (analýzu pevných vzorků za atmosférického tlaku, ASAP-MS). S využitím elektronicky řízeného mikromanipulátoru byly vyizolovány klastry o definovaném počtu pylových zrn, které byly následně umístěny do modifikované kapiláry a přímo analyzovány technikou ASAP-MS. ASAP-MS analýza poskytla informace o chemickém složení studovaných druhů pylových zrn a s využitím PCA analýzy experimentálně získaných dat bylo dosaženo dělení jednotlivých druhů na základě jejich chemické odlišnosti. Byly identifikovány biomarkery, které byly pro daný druh buď specifické nebo byly ve spektrech pozorovány se značně vyšší intenzitou oproti ostatním druhům. Na základě PCA plotu se nejvíce odlišoval borovicový pyl, jediný zástupce jehličnanů a nahosemenných rostlin. Jeho výrazná odlišnost je způsobena malou chemickou variabilitou, která souvisí jak se způsobem šíření pylu, tak i s evoluční zastaralostí a vývojovou izolací studovaného druhu. Ostatní studované druhy, zástupci krytosemenných rostlin, byly děleny na základě chemických odlišností souvisejících s jejich taxonomickou klasifikací, přičemž značnou chemickou odlišnost vykazoval slunečnicový pyl, který je bohatý na charakteristické látky lipidické povahy. Modifikovaná ASAP-MS technika se ukázala jako vhodný nástroj ke studiu chemické variability a charakterizace různých druhů pylu.

Současně byly s využitím mikromanipulátoru izolovány definované počty pylových zrn slunečnice (1 - 10 pylových zrn), které byly vždy vloženy do modifikované kapiláry a následně přímo analyzovány technikou ASAP-MS. Přičemž pozornost byla zaměřena na přítomnost signálu odpovídající helianyl oktanoátu jakožto specifické složky pylového zrna slunečnice. Signál zmíněné látky byl pozorován ve všech spektrech s klesající intenzitou v závislosti na snižujícím se počtu analyzovaných pylových zrn, avšak vždy dostatečně odlišený od pozadí ve spektru. Dosažené výsledky potvrdily využitelnost zavedeného postupu k analýze jednoho pylového zrna umožňující jeho identifikaci a klasifikaci.

Modifikovanou ASAP-MS techniku je možno využít k rychlé a přímé mikroanalýze rozmanitých pevných materiálů rostlinného původu bez předchozí úpravy studovaného vzorku a současně nabízí další možnosti pro analýzu struktur na úrovni jedné buňky nebo buněčné struktury.

17:15 - 17:30 Lipidomic profiling of less abundant lipids in human blood by HILIC/MS

• Ondřej Peterka

The full characterization of the human lipidome is an actual challenge in the lipidomics, but lipids are highly diverse biomolecules with various concentration levels in the biological matrix, making it difficult to determine large numbers of lipids in one analytical method. Injection of the concentrated extract leads to the saturation of the detector or contamination of the mass spectrometer, and signal of a low-abundant lipids is missing in diluted extracts. However, the lipidomic composition usually reflects the actual state of the organism caused by various diseases, such as cancer, neurodegenerative diseases, and cardiovascular diseases. Analysis of all lipid classes within their biosynthetic pathways is therefore essential for understanding lipid dysregulations in human metabolism.

The new hydrophilic interaction liquid chromatography – mass spectrometry (HILIC/MS) method was developed with a focus on the less abundant lipid species in human plasma and serum. The chromatography and mass spectrometry conditions were optimized using 32 standards representing the same number of lipid subclasses. The method is based on the switch of highly abundant lipid classes to the waste, preventing contamination of the mass spectrometer, which enables injection of concentrated lipidomic extract. Highly confident identification based on the combination of high mass accuracy, retention time and retention dependencies in positive and negative ion modes was used, resulting in the identification of 246 lipid species from 24 lipid subclasses in pooled human plasma. The method was validated based on human plasma spiked by 31 internal standards and used for quantitative analysis of SRM 1950 human plasma. In total, 169 lipid species were quantified, and generated results of obtained concentrations were comparable with literature.

Finally, the method was used for the investigation of the lipidomic profile of serum samples obtained from 25 pancreatic cancer patients (PDAC) and 25 healthy controls. Statistical analysis (p-value, VIP values, and fold change) and statistical projection methods (PCA-X, OPLS-DA, S-plot, box plots, and network maps) revealed significant differences in lipid concentrations. In the PDAC samples, the dysregulation corresponding with bonding of fatty acid, where phosphatidylethanolamines (PE) with acyl bonds are upregulated, while PE with ether/plasmenyl bond are downregulated. Downregulations are also observed for lysophospholipids containing C18:2. Moreover, we observe significant downregulation of sphingolipids (SL) with very-long N-acyl chains, together with upregulation of SL with shorter N-acyl chains. These dysregulations are observed in the whole metabolic cascade of SL from ceramide to glycosylated ceramide, indicating the metabolic disorder in the synthesis of ceramide caused by cancer.

SSJMM: Lipidomic profiling of less abundant lipids in human blood by HILIC-MS (Ondřej Peterka)

17:30 - 17:45 Rapid and efficient LC-MS/MS diagnosis of inherited metabolic disorders: a semi-automated workflow for analysis of organic acids, acylglycines, and acylcarnitines in urine

• Barbora Piskláková

Urinary organic acid (OA) analysis is an important part of the diagnosis of inherited metabolic disorders (IMDs), treatment monitoring and detecting possible metabolic crisis. Clinical manifestations of IMD are usually non-specific, thus laboratory analysis of specific biomarkers is crucial for the differential diagnosis. Routinely, OA analysis is performed by GC-MS, which has certain advantages, however, it also has certain shortcomings such as the time-consuming sample preparation and data evaluation and a low sensitivity for OA conjugates. Therefore, an LC-MS/MS method has been developed covering a total of 146 metabolites from a range of urinary organic acids, acylglycines and acylcarnitines. Sample preparation only includes urine dilution to same creatinine concentration and addition of internal standards. Analytes are separated in 26 minutes on the Acquity UPLC HSS T3 C18 (1.8 μm, 100 x 2.1 mm) Waters column using Exion LC (Sciex) and analysed by QTRAP 6500+ (Sciex) in scheduled MRM mode. Raw data processing in is quick and easy as well as the actual data evaluation and diagnostics. A robust standardised value calculation as a data transformation was applied for easy evaluation of complex data. Multiple variables plots in GraphPad Prism software were introduced for simple and automatic data visualisation. The workflow also includes plotting the IMD metabolic network created in Cytoscape software, which can be used to monitor changes in biomarker levels in individual patients and to evaluate dysregulations in their metabolism. The method has been analytically and clinically validated, more than 800 clinical urine samples have already been analysed and 34 IMDs have been correctly diagnosed by this platform. The combination of three groups of biomarkers and the fact that all isomers can be separated allows to diagnose more than 80 IMDs. This work was published in May this year in D1 journal.

SSJMM: Rapid and efficient LC-MS/MS diagnosis of inherited metabolic disorders: a semi-automated workflow for analysis of organic acids, acylglycines, and acylcarnitines in urine (Barbora Piskláková)

17:45 - 18:00 Digitální zobrazování nanočásticových značek pomocí IR laserové ablace spojené s SP ICP MS

• Marek Stiborek

V této práci je prezentována nová technika digitálního mapování biomarkerů ve tkáních založená na desorpci a přesném počítání značek zlatých nanočástic (Au NP) za pomoci infračervené laserové ablace spojené se zobrazovací hmotnostní spektrometrií s indukčně vázaným plazmatem v režimu detekce jednotlivých částic (IR LA SP ICP MS). Transportní účinnost Au NP optimalizovaného IR ablačního systému včetně ablační cely dosahuje 83 %. Ve srovnání s konvenční ultrafialovou (UV) LA dochází během procesu laserové ablace k minimálnímu rozpadu zlatých nanočástic díky jejich nízké absorpci při vlnové délce 2 940 nm. Tento přístup k detekci NP je demonstrován na zobrazování proliferačního markeru jaderného proteinu Ki-67 ve 3D buněčných agregátech (sféroidech) buněčných linií kolorektálního karcinomu HT29 a HCT116 pomocí dvoustupňové metody barvení s biotinylovanou monoklonální protilátkou anti-Ki-67 a konjugátu streptavidinu s Au NP. Výsledky jsou porovnávány s běžnými technikami, jakými jsou konfokální fluorescenční mikroskopie (CFM) a UV LA ICP MSI. Protein Ki-67 byl vybrán díky jeho charakteristickému rozložení ve sféroidu, kde jeho nejvyšší koncentrace je ve vnější proliferační zóně sféroidu a rychle klesá směrem k nekrotickému jádru. Přesné počítání 20nm Au NP s detekčním limitem jedné částice na pixel umožňuje vytvářet ostré digitální mapy distribuce specifických biomarkerů ve tkáni. Kromě toho je v důsledku nepřítomnosti specií absorbujících IR záření silně potlačena desorpce nespecificky vázaných NP značek z oblasti mimo sféroid (sklíčko).

18:00 - 18:30 Využití LC MS/MS v klinické laboratoři a Automatizace v klinické laboratoři

• Martin Švidrnoch (Agel)
• 💾 PDF přednáška ke stažení
• Ondřej Hillmich Shimadzu
• 💾 PDF přednáška ke stažení

SSJMM: Využití LC MS-MS v klinické laboratoři (Martin Švidrnoch)

SSJMM: Automatizace v klinické laboratoři (Ondřej Hillmich)

18:30 - 19:15 PLAKÁTOVÁ SDĚLENÍ – LICHÁ ČÍSLA

19:15 - 20:30 Večeře - raut

20:30 - ??? Společenský večer firmy Shimadzu: Funk, house, electroswing i rádiový pop v podání skupiny The Cupcake Collective

SSJMM: Společenský večer firmy Shimadzu: Funk, house, electroswing i rádiový pop v podání skupiny The Cupcake Collective