Přímá spektrometrie piva a jeho destilátů

Sledovala se absorpční spektra v UV oblasti modelových sloučenin, nealkoholického piva, světlého a tmavého ležáku a světlého ležáku po 10 letech stárnutí. Absorpční spektra zředěného piva vykazovala v UV oblasti typické absorpční maximum v oblasti okolo 260 nm, na jehož tvorbě se podílejí polyfenoly i reduktony piva, pocházející ze sacharidů. Při další oxidaci piva se projevuje nárůst absorbance ve viditelné oblasti, roste podíl oligomerů a polymerů polyfenolů nebo reduktonů, přičemž může následovat jejich další oxidace a degradace. Podobný vzor vykazovaly i další látky, např. α-fenylalanin a z něj vytvořené aldehydy. Ethanol mohl zejména v počátcích oxidace inhibovat tyto nežádoucí reakce. Těkavé produkty sacharidů a α-fenylalaninu poskytovaly podobná maxima jako netěkavé složky, ze kterých vznikla.

1 ÚVOD

Spektroskopické metody jsou v pivovarské a sladařské analytice velmi oblíbené. Představují rozšíření vizuálního posuzování piva a po přídavku vhodných činidel je možné získat informace o jednotlivých sloučeninách i jejich skupinách. Analytika EBC obsahuje spektroskopické metody ve viditelné nebo UV oblasti, většinou po přídavku specifických činidel k pivu nebo meziproduktům jeho výroby.

Výhodou těchto metod je především rychlost a snadná dostupnost spektrometrů v relativně nízkých cenových hladinách. Proto jsou tyto metody velmi oblíbené v laboratorní i provozní kontrole, často v podobě automatických analyzátorů.

Měření absorpčních spekter piva ve viditelné oblasti se využívá v podrobné analýze barvy piva, měření jeho oxidačně redukčních vlastností, v diferenciální spektrofotometrii, v UV spektrometrii při stanovení tzv. absorpčního integrálu (1,2).

Pro získání dalších informací je nutné použít pokročilejší metody s využitím plynové i kapalinové chromatografie, tyto metody však nacházejí zřídka uplatnění v jednoduchých rutinních metodách. Na UV a VIS metody navazují spektrometrické metody v infračervené (IČ) oblasti, s uplatněním při analýzách piva a především surovin pro jeho výrobu (3).

Absorpční spektrum piva představuje klesající funkci ve viditelné oblasti světla, přičemž z praktických důvodů lze využívat oblast 380 až 700 nm, neboť v ní lze bez dalších úprav koncentrace vzorku zaznamenat viditelné spektrum piva v skleněné kyvetě s optickou dráhou 1 cm.

U tmavých piv se vzorky musí ředit, nebo použít kyvety s ještě kratší optickou dráhou. Naopak v oblasti delších vlnových délek se mohou použít kyvety s optickou dráhou až 10 cm, přičemž se zde výraz něji uplatňuje i zákal piva. Spektrometrie zředěného piva v UV oblasti se v poslední době použila k charakterizaci a rozlišení různých piv (4).

2 MATERIÁLY A METODIKA

2.1 Chemikálie

L-askorbová kyselina, galová kyselina, (-)-epikatechin, o-dihydroxybenzen, o-diaminobenzen, α-fenylalanin, manganistan draselný, peroxodisíran draselný (Sigma Aldrich), peroxid vodíku 30 % (Chemické závody Sokolov), ethanol 96 % (Lihovar Chrudim).

2.2 Suroviny, meziprodukty a produkty

Světlý a tmavý ležák odebraný po stočení (původní extrakt 12 % hm.), nealkoholické pivo s obsahem pod 0,5 % obj. alkoholu. Pro porovnání se použil stejný druh světlého ležáku po 10 letech skladování při 20 °C.

Černý (Ceylon), zelený (gun powder) čaj nebo chmel (0,25 g) se přelil 100 ml vroucí vody a po 25 min se nerozpuštěné podíly odstranily filtrací.

2.3 Přístroje a postupy

Spektrofotometr

Spektrofotometr UV/VIS Hach Lange DR 5000 pro měření spekter v rozsahu 190–1100 nm. Jednotlivé sloučeniny, substráty i produkty se rozpustily, nebo se z nich připravily extrakty v deionizované vodě a po případném naředění se snímala absorpční spektra v UV nebo VIS oblasti s automatickým přepínáním rozsahu při 330 nm v křemenné kyvetě s optickou dráhou 10 mm proti deionizované vodě.

Destilátor 1-CUBE

Vzorek (50 ml) se vpravil do destilační baňky přístroje pro přehánění vodní párou s elektrolytickým vyvíječem, po 3 min přehánění se získalo 30 ml destilátu, který se doplnil deionizovanou vodou na původní objem 50 ml.

3 VÝSLEDKY A DISKUSE

3.1 Absorpční spektra vybraných sloučenin po oxidaci manganistanem draselným

Spektra roztoků askorbové a galové kyseliny (obě 25 mg/l), (-)-epikatechinu, o-dihydroxybenzenu, o-diaminobenzenu (všechny 50 mg/l), a světlého piva (1:50) se měřila v rozsahu 240–640 nm (obr.1a). K těmto roztokům se přidal roztok manganistanu draselného (1000 mg/l) v poměru 1:100 (výsledná koncentrace 10 mg/l) a po 1 h při 25 °C se proměřila absorpční spektra roztoků ve stejném rozsahu (obr. 1b).

Kvasný průmysl: Obr. 1b Absorpční spektra roztoků vybraných sloučenin a piva. AA – askorbová kyselina (25 mg/l), GAL – galová kyselina (25 mg/l), EPI – (-)-epikatechin (50 mg/l), DHB – o-dihydroxybenzen (50 mg/l), DHA – o-diaminobenzen (50 mg/l) a piva (1:50) po 1 h oxidace manganistanem draselným (10 mg/l)

V oblasti 240–340 nm vykazovalo zředěné pivo absorpční maximum okolo 260 nm, což odpovídá např. také absorpčnímu maximu askorbové kyseliny. V téže oblasti leží i absorpční maximum polyfenolů i v pivu nepřítomných látek jako jsou o-dihydroxybenzen a o-diaminobenzen, které se mohou považovat za modelový polyfenol a jeho analog s náhradou hydroxylových skupin aminoskupinami. Tato látka se využívá k stanovení α-dikarbonylových látek. Na rozdíl od čistých sloučenin lze na absorpční křivce piva pozorovat postupný pokles absorbance za maximem křivky (obr. 1a).

Kvasný průmysl: Obr. 1a Absorpční spektra roztoků vybraných sloučenin a piva. AA – askorbová kyselina (25 mg/l), GAL – galová kyselina (25 mg/l), EPI – (-)-epikatechin (50 mg/l), DHB – o-dihydroxybenzen (50 mg/l), DHA – o-diaminobenzen (50 mg/l) a piva (1:50)

Polyfenoly se mohou snadno oxidovat roztokem manganistanu draselného, na čemž se zakládají některé metody jejich stanovení v potravinách. Hydroxylové skupiny v o- poloze se tak mění v chinony s typickými absorpčními maximy okolo 260, 400 a 560 nm (5). Tomuto vzoru odpovídá i průběh oxidace, např. epikatechinu, který vykazoval silnou absorbanci při 430 nm a o-diaminobenzenu (při 450 nm), zatímco o-dihydroxybenzen neposkytoval výraznou změnu absorpčního maxima, ale pozvolnější pokles absorbance po jeho dosažení. V roztoku galové kyseliny poklesla hodnota absorpčního maxima a pak následoval pozvolný pokles absorbance bez výraznějších maxim ve viditelné oblasti.

Nárůst absorbance po oxidaci polyfenolů je dobře známým projevem u enzymového i neenzymového hnědnutí potravin i nápojů, jako piva, vína i čaje. S navýšením barvy také souvisí dimerizace až polymerace polyfenolů.

Naproti tomu oxidací téměř vymizelo absorpční maximum askorbové kyseliny, u piva se nepatrně zvýšila hodnota absorpčního maxima, a jeho poloha se posunula k nižším vlnovým délkám (obr. 1a, b). Změny obsahu askorbové kyseliny po jeho přídavku k pivu mohou sloužit jako jednoduchý marker oxidačních procesů piva. Do piva se přitom přidá při stáčení roztok askorbové kyseliny v koncentraci 10–30 mg/l a sledují se oxidační změny jednoduchým měřením poklesu absorpčního maxima zředěného piva.

3.2 Absorpční spektra výluhu chmele a čajů po oxidaci manganistanem draselným

Výluhy chmele a čajů se zředily v poměru 1:50 a změřila jejich spektra v rozmezí 240–640 nm. K těmto roztokům se přidal roztok manganistanu draselného (1000 mg/l) v poměru 1:100 a po 1 h při 25 °C se proměřila absorpční spektra roztoků ve stejném rozsahu.

Oxidovatelnost přírodních polyfenolů se ověřovala u výluhů chmele a čajů, které po zředění vykazovaly také maxima v UV oblasti a jejichž hodnoty se oxidací výrazně zvýšily s pozvolným poklesem absorbance po dosažení maxim (obr. 2 ).

Kvasný průmysl: Obr. 2 Absorpční spektra výluhů chmele, zeleného a černého čaje (1:50) před a po oxidaci manganistanem draselným (10 mg/l)

3.3 Absorpční spektra piv a jejich destilátů

Nealkoholické pivo, světlý a tmavý ležák po stočení a světlý ležák po 10 letech skladování se zředily 1:50 a změřilo se absorpční spektrum v rozmezí 240–640 nm (obr. 3a). Stejným způsobem se změřila spektra vzorků, přeháněných vodní párou (obr. 3b).

Kvasný průmysl: Obr. 3a Absorpční spektra nealkoholického, čerstvého, starého (10 let) a tmavého piva (1:50)

Kvasný průmysl: Obr. 3b Absorpční spektra destilátů nealkoholického, čerstvého, starého (10 let) a tmavého piva

Absorpční spektra zředěných piv vykazovala maxima okolo 260 nm, která jsou typická pro produkty rozkladu sacharidů i oxidace polyfenolů. Podle očekávání odpovídal tento trend i barvě piv ve viditelné oblasti, přičemž čerstvé tmavé pivo mělo výrazně vyšší barvu než velmi staré světlé pivo.

Naproti tomu u destilátů se výrazné absorpční maximum prokázalo při 277 nm, což odpovídá zvýšenému obsahu furfuralu a svědčí o výrazném rozpadu sacharidických složek piva při jeho stárnutí. Zajímavé je i zvýšení absorbance okolo 210 nm, které odpovídá absorpčnímu maximu těkavých složek, např. fenylacetaldehydu.

3.4 Absorpční spektra těkavých látek po oxidaci maltosy a nealkoholického piva

Roztoky maltosy (5 %), dekarbonizované nealkoholické pivo bez a s přídavkem 0,2 % peroxodisíranu draselného nebo ethanolu (5 % obj.) se přehánělo vodní párou a změřila absorpční spektra destilátů při 240 až 340 nm (obr. 4).

Kvasný průmysl: Obr. 4 Absorpční spektra po oxidaci roztoků maltosy (M, 5 %) a nealkoholického piva (FR) s přídavkem peroxodisíranu draselného (PK, 0,2 %) a ethanolu (Et, 5 % obj.) při přehánění vodní párou

Techniky oxidace roztoků piva oxidačními činidly využívá oxidačně destrukční analýza piva (ODA), která upozornila na rozdílné změny vlastností piva po přídavku oxidačních činidel. Po skladování piva s přídavkem peroxodisíranu draselného, nebo amonného se prokázaly všechny typické znaky rychlého stárnutí piva, jako jsou zvýšená barva, tvorba zákalu i výrazný výskyt cizí vůně a chuti (6).

Oxidací maltosy se získaly těkavé látky s absorpčními maximy při 216 a 265 nm, přičemž maximum při 265 nm se vyskytovalo i u nealkoholického piva, které je blízké mladině. Přídavek ethanolu zvyšoval obsah těchto látek v pivu s přídavkem peroxodisíranu draselného i bez něj, což lze vysvětlit buď jejich silnějším rozkladem i inhibicí jejich tvorby. Oxidací tohoto piva peroxodisíranem draselným se také zvyšoval obsah těkavých složek charakterizovaných zvýšením absorbance v okolí 210 nm. Tyto změny odpovídají dříve pozorovaným spektrům při oxidaci sladiny, mladiny a piva (7).

3.5 Vliv ethanolu na tvorbu zákalů oxidací fenylalaninu

Roztok α-fenylalaninu (100 mg/l) s přídavkem 0,1 % peroxodisíranu draselného, popř. s přídavkem ethanolu (5 % obj.) se po 20 min probublávání dusíkem nebo vzduchem zahříval 7 dní při 45 °C a zaznamenala se spektra vzorků i jejich destilátů při 200–640 nm (obr. 5a, b). Při oxidaci fenylalaninu v anaerobním prostředí se navíc tvořil zákal, jehož tvorbě bránil přídavek ethanolu. Tomuto pozorování odpovídá tvorba nerozpustných, pravděpodobně aldehydických, polymerů složek poskytujících zákal. Samovolná polymerace aldehydů je dobře dokumentována (8).

Kvasný průmysl: Obr. 5a Absorpční spektra po oxidaci roztoků fenylalaninu (Ph, 100 mg/l) s přídavkem perodisíranu draselného (PK, 0,2 %) a ethanolu (Et, 5 % obj.), skladovaných 7 dní při 45 °C za přítomnosti (O) a nepřítomnosti vzduchu. (N). Pro porovnání spektrum fenylalaninu (Ph, 100 mg/l) ve vodném roztoku (100 mg/l)

Kvasný průmysl: Obr. 5b Absorpční spektra těkavých látek po oxidaci roztoků fenylalaninu (Ph, 100 mg/l) s přídavkem peroxodisíranu draselného (PK, 0,2 %) a ethanolu (Et, 5 % obj.), skladovaných 7 dní při 45 °C za přítomnosti (O) a nepřítomnosti vzduchu. (N)

Kromě očekávaného nárůstu obsahu těkavých složek je zajímavá podobnost se spektrem benzaldehydu s maximem okolo 250 nm. Tato látka se z fenylalaninu může získat oxidací glyoxalem i peroxodisíranem draselným, přičemž peroxodisíran poskytoval oproti glyoxalu vyšší výtěžek. Podobně měl peroxodisíran draselný proti glyoxalu vyšší oxidační účinek při oxidaci sacharidů (9,10,11).

3.6 Vznik barevných pigmentů z askorbové kyseliny

Roztoky askorbové kyseliny (100 ml, 10 %) bez a s přídavkem peroxidu vodíku, peroxodisíranu draselného, manganistanu draselného (všechny 0,01 %) a ethanolu (5 %) v Erlenmeyerových baňkách (celkový objem 120 ml) se udržovaly 4 dny při 45 °C ve tmě a potom se proměřila spektra neředěných vzorků ve viditelné oblasti 400–640 nm (obr. 6).

Kvasný průmysl: Obr. 6 Absorpční spektra roztoků askorbové kyseliny (AA, 10 %) s přídavkem oxidačních činidel peroxodisíranu draselného (PK, 0,01 %), manganistanu draselného (KMnO4 , 0,01 %), peroxidu vodíku (H2 O2, 0,01 %) a ethanolu (EtOH, 5 % obj.) po zahřívání 7 dní při 45 °C)

Obvykle se silný antioxidant jako je askorbová kyselina považuje za látku schopnou zachycovat silná oxidační činidla, např. kyslíkové radikály. Méně se přihlíží ke skutečnosti, že oxidací askorbové kyseliny vznikají nežádoucí oxidační produkty, jako je dehydroaskorbová kyselina, jejíž rozklad dále vede k tvorbě nežádoucích pokročilých glykačních produktů (AGEs – advanced glycation endproducts). K těmto produktům patří jednoduché aldehydy, opět snadno podléhající polymeraci. Při aerobní a anaerobní oxidaci sacharidů navíc vznikají rozdílné produkty (12).

4 ZÁVĚR

Podle výsledků této studie lze nalézt společné rysy samovolně probíhajících procesů oxidace piva. Po jeho stočení se silně posune oxidačně redukční rovnováha odstraněním kvasnic s aktivními dehydrogenasami, což umožňuje další přenos elektronů z redukčních látek piva na oxidační látky, přičemž mohou vzniknout reaktivní radikály nebo reaktivní formy oxidačních činidel, jako jsou peroxidy a chinony, které dále mohou oxidovat další složky piva. Současně se spotřebovává kyslík přítomný v pivu a hrdlovém prostoru láhve.

Při postupných změnách oxidačně redukčního potenciálu přecházejí aerobní oxidace na anaerobní, což vede k tvorbě rozdílných oxidačních produktů, a tím i různě se projevujícím příznakům stárnutí piva. Zajímavý je i obecný sklon k polymeraci vznikajících složek, oxidovaných polyfenolů, degradačních produktů sacharidů a těkavých aldehydů. Vznik polymerních sloučenin a jejich další oxidační degradace jsou typické i pro oxidace lipidických látek, jejichž oxidací může vznikat malondialdehyd, který vzniká i oxidací sacharidů.

U některých složek může přívod nedostatečného množství kyslíku přispívat k tvorbě nežádoucích produktů, nebo naopak se tyto produkty další oxidací mohou měnit na relativně neškodné sloučeniny. Je zde určitá analogie se spalováním paliva, kdy za nepřístupu vzduchu vzniká škodlivý dým, zatímco produkty hoření za dostatečného přístupu vzduchu poskytují relativně neškodné produkty jako jsou voda a oxid uhličitý. Těchto analogií lze při aerobním a anaerobním stárnutí nalézt mnohem více.

Zajímavý je inhibiční vliv ethanolu na oxidační procesy, přičemž ale vznikají nežádoucí produkty jako radikály ethanolu, acetaldehyd a konečně jeho další oxidační produkty jako kyselina octová. V konečné fázi se opět ethanol může měnit na vodu a oxid uhličitý. Závisí ovšem na stupni škodlivosti těchto látek v porovnání se škodlivými oxidačními produkty sacharidů, např. glyoxalu a methyl -glyoxalu. Radikálové mechanismy redukce dále umožňují tvorby i redukčních produktů, jako superoxidového radikálu, nebo ethylenu. Také dalším rozkladem sacharidů vznikají silně redukující látky.

Obecně se redukční činidla považují za prostředek k oddálení nežádoucích změn, jejich působením však mohou vznikat nežádoucí senzorické sloučeniny jako jsou thioly a redukovat kyslík za vzniku nebezpečných reaktivních oxidačních druhů. Silné oxidační nebo redukční činidlo předává elektrony ostatním složkám piva různou rychlostí, kterou lze zvýšit aktivačními zásahy, jako jsou vyšší teplota, světlo a přísun dalšího množství kyslíku např. pohybem. Po stočení obsahuje pivo v obalu rozpuštěný kyslík, plynný kyslík a jeho sloučeniny v podobě dříve vytvořených látek, které mohou také oxidačně působit v průběhu stárnutí.

Sklon k stárnutí piva tedy vzniká již při ukládání kyslíku do jednotlivých sloučenin již při růstu ječmene.