Nové léčebné terapie a jejich analytika (VIZE 2021)

👉 Pozvánka, registrace a předběžný program semináře Waters VIZE 2022 dne 22. listopadu 2022

Příslib genových terapií

• Známe generický kód - můžeme léčit jakoukoliv nemoc

• Obecný mechanismus - specifický DNA cíl

• Nejen léčit - vyléčit!

  • Oligonukleotidy (AON, siRNA)
  • mRNA
  • Virové vektory
  • Crisper/Cas 9
  • Modifikované T buňky (CAR-T)

• Individuální terapie

• Vzácné nemoci

• Běžné nemoci

Nové genové terapie

Vyřešené problémy:

• Syntéza a bio syntéza
• Doprava do buněk a orgánů
• Stabilita
• Vedlejší účinky a toxicita
• Analytické metody

Waters Corporation/Martin Gilar: “Clinical Development of Gene Therapies: The First Three Decades and Counting”

Nové terapie vstupují na scénu

• Genové terapie
• Buněčné terapie
• mAbs + ostatní proteiny
• Jiné
• Malé molekuly

Waters Corporation/Martin Gilar: Evaluate Pharma, June 2020

Co jsou to Nové Modality?

Traditional Biotherapeutics

mAb & mAb fragments

• 150 kD , <150kD

Antibody Drug Conjugates

• ~152 kD

Virus Like Particles

• No viral genome

Proteins & Peptides

• Peptides < 6 kDa

Bispecific & Trispecific mAb, Fusion proteins

• Bi & Tri mAb > 150 kDa

Waters Corporation/Martin Gilar: Co jsou to Nové Modality?

Emerging New Modalities / Advanced Therapies

Viral Vectors

• Gene Therapy
• AAV (ø20nm): 3700 kDa
• Adenovirus & Lentivirus (ø90)

Cell Therapy

• Most common, CAR-T autologous or allogeneic cells

Transgene

• Genetic material delivered for CGT

pDNA

• 607 kDa (1000 bp)
• Foundation of biosynthesis; emerging therapeutic/vaccine

mRNA

• 960 - 1600 kDa (300 5000 nt) cell free bioprocess

CRISPR Cas

• Gene Editing
• gRNA, 100 nt , 32.2 kDa
• Cas protein 163 kDa

Oligos

• Gene Silencing
• siRNA, RNAi, ASO
• 21 - 23 nt; 6.9 - 7.6 kDa

Antisense oligonukleotidy , siRNA , miRNA

Umíme selektivně zapnout a vypnout geny.

Chromatografické metody analýzy oligonukleotidů

Reversed Phase Ion Pairing

Waters Corporation/Martin Gilar: Chromatografické metody analýzy oligonukleotidů - Reversed Phase Ion Pairing (M. Gilar, F. Gritti, J. Nguyen, C. Doneanu, H. Yang, S. Rzewuski, M. Lauber)

HILIC

Waters Corporation/Martin Gilar: Chromatografické metody analýzy oligonukleotidů - HILIC (M. Gilar, F. Gritti, J. Nguyen, C. Doneanu, H. Yang, S. Rzewuski, M. Lauber)

Anion Exchange

Waters Corporation/Martin Gilar: Chromatografické metody analýzy oligonukleotidů - Anion Exchange (M. Gilar, F. Gritti, J. Nguyen, C. Doneanu, H. Yang, S. Rzewuski, M. Lauber)

LC MS aplikace

Application Solutions for oligonucleotides

• UPLC-MS Analysis of Interfering RNA Oligonucleotides

  • Detection and quantitation of process related impurities from synthesis as well as modification or truncations of the oligonucleotide.

• UPLC Analysis of Phosphorothioate Oligonucleotides: Method Development

  • A single analysis method applied to antisense oligonucleotides that replaces the need for multi step post purification methods.

Intact Mass Confirmation Analysis on the BioAccord LC-MS System for a Variety of Extensively Modified Oligonucleotides

Compliance Ready LC-MS workflow for mass confirmation for unmodified and extensively modified oligonucleotides using the BioAccord.

Waters Corporation/Martin Gilar: LC-MS aplikace analýzy oligonukleotidů

Technologie CRISPR-Cas9 - permanentní editace genů

• Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
• Bakteriální obranný mechanismus - „genetická paměť”
• Cas9 - nukleáza, štípe dsDNA
• 100 mer guideRNA gRNA) - určí štěpné místo
• Jennifer Doudna 2020 Nobel prize

Separace 5-100 dT oligonukleotidů

• ACQUITY PREMIER Oligonucleotide BEH C18, 130 Å, 1.7 µm, 2.1 x 150 mm column

• Mobile phase A: 100 mM Hexylammonium acetate pH 8 (HAA) : MeCN , 75 : 25 v:v

• Mobile phase B: 100 mM HAA : MeCN , 25 : 75 v:v

• Conditions: 60 °C, 0.4 mL/min, UV 260 nm, gradient 15-50% B in 60 minutes

Waters Corporation/Martin Gilar: Separace 5-100 dT oligonukleotidů

Anatomie mRNA - principy mRNA technologie

• 1970’ - struktura a funkce 3 ’ polyA konce
• 1970’ - struktura a funkce 5’ “čepice”
• 1985 - biosyntéza mRNA (T7-RNA polymeráza)
• 1987 - komercializace PCR a Taq polymerázy
• 1980 - 2010’ - vývoj lipidových nanočástic
• 2005 - modifikovaná mRNA - minimálně imunogenní
• 2014 - mRNA technologie funguje

LC-UV Chromatograms of mRNA using IP-RPLC

• ACQUITY Premier Oligonucleotide Column, 2.1 x 50 mm, 1.7 µm, 130 Å, DIPEA/HFIP Mobile Phase System

Waters Corporation/Martin Gilar: LC-UV Chromatograms of mRNA using IP-RPLC

HILIC analysis of RNase T1 digest

• rArArArGrArArArArCrArGrArArArUrArArATT - 20 mer, 6457.1 Da
• rArArArG-PO₃H - 4 mer, 1350.9 Da
• rArArArArCrArG-PO₃H - 7 mer, 2314.5 Da
• ArArArUrArArATT - 9 mer, 2827.8 Da

Waters Corporation/Martin Gilar: HILIC analysis of RNase T1 digest

EPO mRNA mapping - RNase T1 digest

Waters Corporation/Martin Gilar: EPO mRNA mapping - RNase T1 digest

RNase H digest, 5’Cap LC-MS analýza

Waters Corporation/Martin Gilar: RNase H digest, 5’Cap LC-MS analýza

Doprava mRNA do buněk a Složení lipidových nanočástic LC-ELSD

• 2.1 x 50 mm 1.7 µm CSH Phenyl-Hexyl kolona

Waters Corporation/Martin Gilar: Doprava mRNA do buněk a Složení lipidových nanočástic LC-ELSD

• (2) Cationic Lipid (Patented) ((6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriacont-6,9,28,31-tetraene-19-yl-4-(dimethylamino)butanoate
• (3) Cholesterol (Cholesterol USP)
• (1) Phospholipid (18:0/18:0) PC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)
• (4) PEGylated Lipid (1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol 2000)

mRNA vakcíny: Úspěch otevírá dveře dalším terapiím

• Rakovinová Imunoterapie (e.g. CAR-T)
• Vakcíny (COVID-19, chřipka, Zika, tuberkulóza, malárie…)
• Náhrada proteinů (Hemo fílie typu B)
• Editování genů
• Programování buněk (stem cells)

CAR-T: Chimeric antigen receptor T-cell

• Ex-vivo modifikace
• Pouze T-buňky (T-lymfocyty) jsou modifikovány; mRNA vyprodukuje CAR protein
• mRNA je meziprodukt pro ssDNA kódující Crispr-Cas9 komplex. ssDNA je vložena do T-lymfocytů. Crispr-Cas9 přeprogramuje buňku na CAR T-cell.
• Ex-vivo postup minimalizuje možnost nežádoucí genové změny „mimo cíl“ - v jiných typech buněk
• 5 komerčních Car-T terapií

Waters Corporation/Martin Gilar: CAR-T: Chimeric antigen receptor T-cell

Anatomie virových vektorů

• DNA je vložena do buněčného jádra

Adeno Associated Viry (AAV)

• Malé nepatogenní viry, hmotnost 4.8 MDa (ekvivalent 32 mAb)
• AAV se skládá z 60 proteinů
• VP1 : VP2 : VP3 ~ 5:5:50
• VP MW: 60, 67, 82 kDa ; 25 nm , velikost 2.5x mAb
• Nálož ssDNA , 4.5 kb limit

Adeno Viry ( AdV )

• Středně velké viry, hmotnost 150 MDa (ekvivalent 100 mAb)
• AdV se skládá z 252 proteinů, 240 hexonů , 12 pentonů
• 129 kDa , 51.1 kDa ; velikost 90-100 nm , 4x mAb
• Nálož dsDNA, 32 43 kb
• Sputnik V (AdV26, AdV5), Janssen (AdV26), AstraZeneca (AdV26)

Analýza virových částic

• Prázdná AAv obálka
• Nekompletní DNA obsah
• AAv s cílovou DNA

Waters Corporation/Martin Gilar: Analýza virových částic

LC and LC/MS technologie pro kontrolu AAV terapií

SEC-FLR-UV

• Purify and measure intrinsic fluorescence

IEX-UV

• Measure difference in surface charge profile

RPLC-UV-MS

• Measure difference in hydrophobicity profile

Peptide Mapping

• AA sequence and PTMs

Analýza oligonukleotidů a nukleových kyselin

Příprava vzorků

• Titrační destičky, Vialky MaxPeak

Kvantifikace

LC-UV, LC-MS, ACQUITY Premier

Separace

• Iontově párové systémy, OST vzorky

Kolony Premier

• BEH C18 OST
• BEH Phenyl
• BEH AMIDE HILIC

Speciální aplikace

• SEC, IEX, RP analýza nukleotidů

Charakterizace

• Sekvencování/analýza modifikací
• LC/MS ToF , QTof

Waters Corporation: Komplexní řešení a příklady analýz ACQUITY PREMIER

Analýza nukleových kyselin s HPS technologií

• High Performance Surface s (HPS)

Více než 100 dostupným dokumentů pro analýzu oligonucleotidů pomocí HPLC / LC-MS od Waters Corporation dostupných ke stažení v knihovně LabRulezLCMS