Nové léčebné terapie a jejich analytika (VIZE 2021)

Foto/Video: Waters Corporation: Nové léčebné terapie a jejich analytika (VIZE 2021)
👉 Pozvánka, registrace a předběžný program semináře Waters VIZE 2022 dne 22. listopadu 2022
Příslib genových terapií
Známe generický kód - můžeme léčit jakoukoliv nemoc
Obecný mechanismus - specifický DNA cíl
Nejen léčit - vyléčit!
- Oligonukleotidy (AON, siRNA)
- mRNA
- Virové vektory
- Crisper/Cas 9
- Modifikované T buňky (CAR-T)
Individuální terapie
Vzácné nemoci
Běžné nemoci
Nové genové terapie
Vyřešené problémy:
- Syntéza a bio syntéza
- Doprava do buněk a orgánů
- Stabilita
- Vedlejší účinky a toxicita
- Analytické metody
Waters Corporation/Martin Gilar: “Clinical Development of Gene Therapies: The First Three Decades and Counting”
Nové terapie vstupují na scénu
- Genové terapie
- Buněčné terapie
- mAbs + ostatní proteiny
- Jiné
- Malé molekuly
Waters Corporation/Martin Gilar: Evaluate Pharma, June 2020
Co jsou to Nové Modality?
Traditional Biotherapeutics
mAb & mAb fragments
- 150 kD , <150kD
Antibody Drug Conjugates
- ~152 kD
Virus Like Particles
- No viral genome
Proteins & Peptides
- Peptides < 6 kDa
Bispecific & Trispecific mAb, Fusion proteins
- Bi & Tri mAb > 150 kDa
Waters Corporation/Martin Gilar: Co jsou to Nové Modality?
Emerging New Modalities / Advanced Therapies
Viral Vectors
- Gene Therapy
- AAV (ø20nm): 3700 kDa
- Adenovirus & Lentivirus (ø90)
Cell Therapy
- Most common, CAR-T autologous or allogeneic cells
Transgene
- Genetic material delivered for CGT
pDNA
- 607 kDa (1000 bp)
- Foundation of biosynthesis; emerging therapeutic/vaccine
mRNA
- 960 - 1600 kDa (300 5000 nt) cell free bioprocess
CRISPR Cas
- Gene Editing
- gRNA, 100 nt , 32.2 kDa
- Cas protein 163 kDa
Oligos
- Gene Silencing
- siRNA, RNAi, ASO
- 21 - 23 nt; 6.9 - 7.6 kDa
Antisense oligonukleotidy , siRNA , miRNA
Umíme selektivně zapnout a vypnout geny.
Chromatografické metody analýzy oligonukleotidů
Reversed Phase Ion Pairing
Waters Corporation/Martin Gilar: Chromatografické metody analýzy oligonukleotidů - Reversed Phase Ion Pairing (M. Gilar, F. Gritti, J. Nguyen, C. Doneanu, H. Yang, S. Rzewuski, M. Lauber)
HILIC
Waters Corporation/Martin Gilar: Chromatografické metody analýzy oligonukleotidů - HILIC (M. Gilar, F. Gritti, J. Nguyen, C. Doneanu, H. Yang, S. Rzewuski, M. Lauber)
Anion Exchange
Waters Corporation/Martin Gilar: Chromatografické metody analýzy oligonukleotidů - Anion Exchange (M. Gilar, F. Gritti, J. Nguyen, C. Doneanu, H. Yang, S. Rzewuski, M. Lauber)
LC MS aplikace
Application Solutions for oligonucleotides
UPLC-MS Analysis of Interfering RNA Oligonucleotides
- Detection and quantitation of process related impurities from synthesis as well as modification or truncations of the oligonucleotide.
UPLC Analysis of Phosphorothioate Oligonucleotides: Method Development
- A single analysis method applied to antisense oligonucleotides that replaces the need for multi step post purification methods.
Intact Mass Confirmation Analysis on the BioAccord LC-MS System for a Variety of Extensively Modified Oligonucleotides
Compliance Ready LC-MS workflow for mass confirmation for unmodified and extensively modified oligonucleotides using the BioAccord.
Waters Corporation/Martin Gilar: LC-MS aplikace analýzy oligonukleotidů
Technologie CRISPR-Cas9 - permanentní editace genů
- Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
- Bakteriální obranný mechanismus - „genetická paměť”
- Cas9 - nukleáza, štípe dsDNA
- 100 mer guideRNA gRNA) - určí štěpné místo
- Jennifer Doudna 2020 Nobel prize
Separace 5-100 dT oligonukleotidů
ACQUITY PREMIER Oligonucleotide BEH C18, 130 Å, 1.7 µm, 2.1 x 150 mm column
Mobile phase A: 100 mM Hexylammonium acetate pH 8 (HAA) : MeCN , 75 : 25 v:v
Mobile phase B: 100 mM HAA : MeCN , 25 : 75 v:v
Conditions: 60 °C, 0.4 mL/min, UV 260 nm, gradient 15-50% B in 60 minutes
Waters Corporation/Martin Gilar: Separace 5-100 dT oligonukleotidů
Anatomie mRNA - principy mRNA technologie
- 1970’ - struktura a funkce 3 ’ polyA konce
- 1970’ - struktura a funkce 5’ “čepice”
- 1985 - biosyntéza mRNA (T7-RNA polymeráza)
- 1987 - komercializace PCR a Taq polymerázy
- 1980 - 2010’ - vývoj lipidových nanočástic
- 2005 - modifikovaná mRNA - minimálně imunogenní
- 2014 - mRNA technologie funguje
LC-UV Chromatograms of mRNA using IP-RPLC
- ACQUITY Premier Oligonucleotide Column, 2.1 x 50 mm, 1.7 µm, 130 Å, DIPEA/HFIP Mobile Phase System
Waters Corporation/Martin Gilar: LC-UV Chromatograms of mRNA using IP-RPLC
HILIC analysis of RNase T1 digest
- rArArArGrArArArArCrArGrArArArUrArArATT - 20 mer, 6457.1 Da
- rArArArG-PO₃H - 4 mer, 1350.9 Da
- rArArArArCrArG-PO₃H - 7 mer, 2314.5 Da
- ArArArUrArArATT - 9 mer, 2827.8 Da
Waters Corporation/Martin Gilar: HILIC analysis of RNase T1 digest
EPO mRNA mapping - RNase T1 digest
Waters Corporation/Martin Gilar: EPO mRNA mapping - RNase T1 digest
RNase H digest, 5’Cap LC-MS analýza
Waters Corporation/Martin Gilar: RNase H digest, 5’Cap LC-MS analýza
Doprava mRNA do buněk a Složení lipidových nanočástic LC-ELSD
- 2.1 x 50 mm 1.7 µm CSH Phenyl-Hexyl kolona
Waters Corporation/Martin Gilar: Doprava mRNA do buněk a Složení lipidových nanočástic LC-ELSD
- (2) Cationic Lipid (Patented) ((6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriacont-6,9,28,31-tetraene-19-yl-4-(dimethylamino)butanoate
- (3) Cholesterol (Cholesterol USP)
- (1) Phospholipid (18:0/18:0) PC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)
- (4) PEGylated Lipid (1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol 2000)
mRNA vakcíny: Úspěch otevírá dveře dalším terapiím
- Rakovinová Imunoterapie (e.g. CAR-T)
- Vakcíny (COVID-19, chřipka, Zika, tuberkulóza, malárie…)
- Náhrada proteinů (Hemo fílie typu B)
- Editování genů
- Programování buněk (stem cells)
CAR-T: Chimeric antigen receptor T-cell
- Ex-vivo modifikace
- Pouze T-buňky (T-lymfocyty) jsou modifikovány; mRNA vyprodukuje CAR protein
- mRNA je meziprodukt pro ssDNA kódující Crispr-Cas9 komplex. ssDNA je vložena do T-lymfocytů. Crispr-Cas9 přeprogramuje buňku na CAR T-cell.
- Ex-vivo postup minimalizuje možnost nežádoucí genové změny „mimo cíl“ - v jiných typech buněk
- 5 komerčních Car-T terapií
Waters Corporation/Martin Gilar: CAR-T: Chimeric antigen receptor T-cell
Anatomie virových vektorů
- DNA je vložena do buněčného jádra
Adeno Associated Viry (AAV)
- Malé nepatogenní viry, hmotnost 4.8 MDa (ekvivalent 32 mAb)
- AAV se skládá z 60 proteinů
- VP1 : VP2 : VP3 ~ 5:5:50
- VP MW: 60, 67, 82 kDa ; 25 nm , velikost 2.5x mAb
- Nálož ssDNA , 4.5 kb limit
Adeno Viry ( AdV )
- Středně velké viry, hmotnost 150 MDa (ekvivalent 100 mAb)
- AdV se skládá z 252 proteinů, 240 hexonů , 12 pentonů
- 129 kDa , 51.1 kDa ; velikost 90-100 nm , 4x mAb
- Nálož dsDNA, 32 43 kb
- Sputnik V (AdV26, AdV5), Janssen (AdV26), AstraZeneca (AdV26)
Analýza virových částic
- Prázdná AAv obálka
- Nekompletní DNA obsah
- AAv s cílovou DNA
Waters Corporation/Martin Gilar: Analýza virových částic
LC and LC/MS technologie pro kontrolu AAV terapií
SEC-FLR-UV
- Purify and measure intrinsic fluorescence
IEX-UV
- Measure difference in surface charge profile
RPLC-UV-MS
- Measure difference in hydrophobicity profile
Peptide Mapping
- AA sequence and PTMs
Analýza oligonukleotidů a nukleových kyselin
Příprava vzorků
- Titrační destičky, Vialky MaxPeak
Kvantifikace
LC-UV, LC-MS, ACQUITY Premier
Separace
- Iontově párové systémy, OST vzorky
Kolony Premier
Speciální aplikace
- SEC, IEX, RP analýza nukleotidů
Charakterizace
- Sekvencování/analýza modifikací
- LC/MS ToF , QTof
Waters Corporation: Komplexní řešení a příklady analýz ACQUITY PREMIER
Analýza nukleových kyselin s HPS technologií
- High Performance Surface s (HPS)
Více než 100 dostupným dokumentů pro analýzu oligonucleotidů pomocí HPLC / LC-MS od Waters Corporation dostupných ke stažení v knihovně LabRulezLCMS
