Tipy a triky v HPLC: Ultra fast high temperature LC (UFHTLC)

Zvýšením teploty na chromatografické koloně dochází:

a) k dramatickému snížení viskozity mobilní fáze: (1)

HPLC.cz: Výpočet viskozity mobilní fáze

kde A, B jsou empirické konstanty, charakteristické pro danou látku.

Ze vztahu je zřejmé, že s rostoucí teplotou se viskozita ɳ mobilní fáze snižuje a účinnost kolony se zvyšuje. Závislost koeficientu C Van deemterovy rovnice na viskozitě je lineární a z toho vyplývá, že pro zmenšení rozmývání chromatografických píků, tj. zvýšení účinnosti kolony, je nutno používat méně viskózní eluční činidla.

b) ke změně difuzních koeficientů solutu

Hodnoty difúzních koeficientů v mobilní fázi lze vypočítat podle Wilkovy-Changovy rovnice:

HPLC.cz: Wilkova-Changova rovnice pro výpočet hodnoty difúzních koeficientů v mobilní fázi

• T je teplota v K
• vmol je molární objem rozpuštěné látky (l/mol)
• Mr je relativní molekulová hmotnost látky
• ɳ je dynamická viskozita rozpouštědla (Pa.s)
• Ψ asociační faktor, který je 2,6 pro vodu, 1,9 pro methanol a pro většinu rozpouštědel je 1

Podle Wilkovy-Changovy rovnice roste difúze se stoupající teplotou a klesající viskozitou mobilní fáze.

Jak již bylo uvedeno, odpor proti převodu hmoty (HS, HM) je mnohem významnější než molekulová difúze ML při rychlostech toku mobilní fáze používaných v kapalinové chromatografii. Potom se tedy výškový ekvivalent teoretického patra snižuje s rostoucí Dm a účinnost kolony bude tedy větší při vyšší teplotě, menší viskozitě mobilní fáze.

Snížení viskozity mobilní fáze dovoluje zvýšit lineární rychlost mobilní fáze. (2)

Na obrázku 1 je ukázán vliv teploty na dynamickou viskozitu mobilní fáze

Na obrázku 2 pak vliv teploty na účinnost chromatografického systému v závislosti na lineární rychlosti mobilní fáze.

HPLC.cz: Obr. 1 Vliv teploty na viskozitu mobilní fáze

HPLC.cz: Obr. 2 Vliv teploty na účinnost separačního procesu

Zvýšením teploty na chromatografické koloně můžeme tedy výrazně zvýšit lineární rychlost mobilní fáze beze ztráty účinnosti separace.

Objemová průtoková rychlost mobilní fáze se v praxi pohybuje od 3 do 10 ml/min a teplota se pohybuje okolo 60 až 150 °C v závislosti na použité stacionární a mobilní fáze.

Technika v UFHTLC

K výraznému rozšíření této techniky brání o něco složitější HPLC technika nutná k zajištění ohřevu mobilní fáze a temperaci HPLC systému. Blokové schéma UFHTLC chromatografu je na obrázku 3.

Ve srovnání s klasickou HPLC je nutné temperovat nástřikové zařízení, kolonu i detektor. Mezi kolonou a detektorem se většinou zařazuje chladič, který musí ochladit mobilní fázi na teplotu nižší než 60 °C resp. na teplotu, která je nižší než teplota detektoru.

Důležité je vyhřátí mobilní fáze na teplotu, která je použita na chromatografické koloně, proto se používá smyčka, která je temperována na teplotu stejnou jako chromatografická kolona. Někdy se ještě používá předehřátí mobilní fázi před vstupem do nástřikového zařízení.

Nezbytnou součástí HPLC chromatografu je také zpětný regulátor tlaku, který se používá na výstupu z detektoru. Změnou teploty mobilní fáze dochází k uvolňování rozpuštěných plynů v mobilní fázi a tím i zavzdušňování mobilní fáze a k eliminaci tohoto jevu se používá právě zpětný regulátor tlaku.

HPLC.cz: Obr. 3 Schéma chromatografu UFHTLC

Předehřátí mobilní fáze na teplotu separace má vliv na rozšíření eluční zóny. Tento příspěvek je dán jednak jako mimokolonový příspěvek k rozšíření eluční zóny a tzv. termální příspěvek. (3)

Pro celkové rozšíření eluční zóny platí:

HPLC.cz: Výpočet celkového rozšíření eluční zóny

• σ je příspěvek kolony
• σm je příspěvek mimokolonový
• σT je právě termální příspěvek

Termální příspěvek σT souvisí s ohřevem mobilní fáze a kolony. Je-li teplota mobilní fáze, která vstupuje do kolony nižší než teplota kolony, pak dochází k postupnému podélnému ohřevu mobilní fáze na koloně, současně se příčný ohřev opožďuje a uvnitř kolony je teplota mobilní fáze nižší než u stěn kolony. Tím dochází k teplotnímu gradientu na koloně a to jak radiálnímu tak axiálnímu a příspěvek σT se zvyšuje (obrázek 4).

Další mimokolonový příspěvek σm souvisí se způsobem ohřevu kolony a mobilní fáze. Nutnost ohřevu mobilní fáze způsobuje zvýšení mrtvých objemů systému daných délkou a průměrem kapiláry, ale i způsobem ohřevu. V případě ohřevu kapiláry přes kterou protéká mobilní fáze olejovou lázní, se zkracuje délka kapiláry oproti ohřevu horkým vzduchem. (4)

Tím se snižuje i mimokolonový příspěvek k rozšíření eluční zóny (obrázek 5).

HPLC.cz: Obr. 4 Vliv radiálního a axiálního teplotního gradientu na rozšíření eluční zóny

HPLC.cz: Obr. 5 Způsobu ohřevu mobilní fáze