LCMS
Další informace
WebinářeO násKontaktujte násPodmínky užití
LabRulez s.r.o. Všechna práva vyhrazena. Obsah dostupný pod licencí CC BY-SA 4.0 Uveďte původ-Zachovejte licenci.
Autor
Česká chromatografická škola
Česká chromatografická škola
Našim cílem je propagace, šíření a podpora analytické chemie, především HPLC, GC a CE, jako základních separačních metod. Vzdělávání v oblasti separačních metod bychom chtěli pojmout jako kontinuální proces získávání a rozvoje vědomostí, intelektových schopností a praktických dovedností nad rámec obecného vzdělání.
Tagy
Článek
Akademie
LinkedIn Logo

Tipy a triky v HPLC: Dvourozměrná chromatografie 2D HPLC

Čt, 14.7.2022
| Originální článek z: Česká chromatografická škola/Michal Douša
Hledání možnosti zvýšení píkové kapacity chromatografické kolony a tím i počtu analytů, které mohou být separovány v jediném nástřiku, vedlo ke vzniku vícerozměrné HPLC.
<p>Wikipedia/YassineMrabet: Tipy a triky v HPLC: Dvourozměrná chromatografie 2D HPLC</p>

Wikipedia/YassineMrabet: Tipy a triky v HPLC: Dvourozměrná chromatografie 2D HPLC

Hledání možnosti zvýšení píkové kapacity chromatografické kolony a tím i počtu analytů, které mohou být separovány v jediném nástřiku, vedlo ke vzniku vícerozměrné HPLC.

Při klasické „off-line“ HPLC se postupuje tak, že se sbírá určitá vybraná frakce ze semipreparativní kolony, které se následně analyzuje na druhé chromatografické koloně. Vybraná frakce se většinou sbírá do vialky a poté se nastřikuje nezávisle na druhou chromatografickou kolonu. Tento experiment vyžaduje dva nezávislé chromatografické systémy a případná automatizace této metody vyžaduje velmi složité technické zařízení.

Při on-line 2D chromatografii jsou přímo spojené dvě nebo více chromatografických kolon přímo spojeny přes přepínací ventil v jediném chromatografickém systému. V ideálním případě je snaha sbírat veškerý efluent z první kolony a nastřikovat jej na kolonu druhou. Bohužel v praxi se na druhou kolonu nanáší pouze efluent obsahující soluty, která nás zajímají.

Uspořádání 2D HPLC

Vícerozměrné (multidimensionální, 2D) separační techniky poskytují dramatické zvýšení píkové kapacity a celková píková kapacita je rovna píkové kapacitě v obou systémech, což vede k daleko vyššímu rozlišení. Pro píkovou kapacitu v jednom systému můžeme napsat:

HPLC.cz: Výpočet píkové kapacity jednoho chromatografického sytémuHPLC.cz: Výpočet píkové kapacity jednoho chromatografického sytému

kde n je počet teoretických pater a kmax je kapacitní poměr posledního eluujícího píku. Píková kapacita roste s účinností kolony a s dobou analýzy a klesá s požadovaným vyšším rozlišením R₁,₂.

Při 2D HPLC musí být splněny dvě podmínky:

1. orthogonalita separačního mechanismu

2. účinnost separace získaná v jednom systému nemůže být snížena separací v systému druhém. (1)

Když jsou splněny obě podmínky, pak maximální celková píková kapacita PcTotal dvourozměrného chromatografického sytému je

HPLC.cz: Výpočet celkové píkové kapacity dvourozměrného chromatografického sytémuHPLC.cz: Výpočet celkové píkové kapacity dvourozměrného chromatografického sytému

Bohužel primární kolona produkuje mnohem větší počet vzorků, než je sekundární kolona může zpracovat. V případě, že je průtok na primární koloně 1 ml/min a doba analýzy je 5 minut pak při nástřiku 50 µl na sekundární kolonu je pak nutné, aby sekundární kolona zpracovala 100 vzorků.

Jestliže bude tedy průtok a doba analýzy na obou kolonách podobná, pak bude vyžadována 100 sekundárních kolon, aby se dosáhlo tohoto zdánlivě jednoduchého úkolu. Zobecněno, počet sekundárních kolon roste s retenčním časem na primární koloně.

Dávkováním efluentu, který obsahuje pouze píky, které nás zajímají, se pak snižuje počet sekundárních kolon na jednu až dvě kolony.

Typický systém pro online 2D HPLC zahrnuje dva chromatografy (čerpadla, kolony, detektory, nástřiková zařízení a kapiláry, které spojují všechny moduly s přepínacími ventily) řízené počítačem.

Eluent z primární kolony prochází přes první detektor a potom přes smyčku přepínacího ventilu a to buď do odpadu nebo do druhého obvodu systému se sekundární kolonou. Přepnutí ventilu řídí počítač v okamžiku, kdy detektorem prochází pík solutu, který nás zajímá.

Přepínací ventil v tomto případě reprezentuje nástřik na sekundární kolonu namísto autosampleru. Při řízení přepínacího ventilu je nezbytné přesné časování přepínání ventilu ke kompenzaci časové prodlevy mezi detektorem a smyčkou (obrázek 1).

HPLC.cz: Obr. 1 Schéma 2D HPLCHPLC.cz: Obr. 1 Schéma 2D HPLC

Kompatibilta mobilních fází

Selektivita je při separaci komplexních směsí důležitý faktor a proto mohou být použity rozdílné chromatografické módy v obou dimenzích tak, abychom dosáhli co nejvyšší separace.

Bohužel pro každý chromatografický mód je charakteristické použití rozdílných mobilních fází, které nejsou zcela vždy kompatibilní. Jako příklad je možné uvést použití gelové permeační chromatografie jako chromatografický mód v primárním módu, kde se nejčastěji používá jako mobilní fáze tetrahydrofuran, který je dobře mísitelný s mobilními fázemi normální i reverzní fáze, které mohou být použity v sekundárním chromatografickém módu. Na druhou stranu, normální fáze použitá v prvním módu není kompatibilní s reverzní fází použité v módu druhém.

Pseudo 2D HPLC

Dvourozměrná HPLC s jednou chromatografickou kolonu zjednodušuje koncept vícerozměrné chromatografie zahrnující následné separace ve dvou rozdílných mobilních fázích. Jako příklad je možné uvést použití konvenční reverzní fáze C18, která se použije pro separaci nabitých a neutrálních malých organických molekul a peptidů.

V prvním módu, se gradient pH vodné mobilní fáze použije pro pozvolnou ionizaci nabitých organických molekul. Ve druhém módu se gradientem methanolu ve vodných pufrovaných mobilních fázích eluují neutrální hydrofobní molekuly , které se dosud zadržovaly na počátku chromatografické kolony během prvního kroku.

Tento typ eluce je obvykle řízen pouze změnou složení mobilní fáze, protože stacionární fáze zůstává stejná pro každý separační krok. Tento typ separace není pravá dvourozměrná chromatografie, protože vysokomolekulární látky nejsou separovány.

Zdroje
  • (1) Murphy R.E., Shure M.R., Foley J.P.: Anal.Chim. 70, 1585 (1998).
Česká chromatografická škola
LinkedIn Logo
 

Mohlo by Vás zajímat

Analyzing 193 Veterinary Drug Residues in Livestock and Poultry Meat

Aplikace
| 2025 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Targeted LC-MS/MS detection of lipid impurities in lipid nanoparticles

Aplikace
| N/A | KNAUER
Instrumentace
HPLC, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
KNAUER, SCIEX
Zaměření
Farmaceutická analýza, Lipidomika

Choosing Appropriate Pore Size Columns for Size Exclusion Chromatography of Oligonucleotides

Aplikace
| 2025 | Agilent Technologies
Instrumentace
GPC/SEC, Spotřební materiál, LC kolony
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Farmaceutická analýza

Polysorbate Degradation Analysis with the AdvanceBio Surfactant Profiling HPLC Column

Příručky
| 2025 | Agilent Technologies
Instrumentace
Spotřební materiál, LC kolony
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Farmaceutická analýza

Simultaneous Analysis of Synthetic Colorants, Including Red No. 3, Using an Organic Silica Hybrid Core-Shell Column

Aplikace
| 2025 | Shimadzu
Instrumentace
Spotřební materiál, LC kolony, HPLC
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství
 

Podobné články

Shimadzu HPLC Blog: Retenční faktor (k)
Článek | Akademie

Shimadzu HPLC Blog: Retenční faktor (k)

Dnešní článek navazuje na předchozí díly a zaměřuje se na klíčový pojem retenčního faktoru (k), který pomáhá definovat, co znamená „adekvátní retence“ při vývoji chromatografické metody.
SHIMADZU Handels GmbH - organizační složka
tag
share
more
Metodický list 26 – Nazývejme program PT správně!
Článek | Akademie

Metodický list 26 – Nazývejme program PT správně!

Mezilaboratorní porovnání se používají přes 100 let. Leták objasňuje jejich terminologii, problémy se zavádějícími pojmy a důležitost harmonizace.
Eurachem-ČR
tag
share
more
Podcast CHEmic #51 – Termiti zvítězili v evoluci tím, že si rozdělili práci. Zbytek obstarává chemie
Video | Osobnosti

Podcast CHEmic #51 – Termiti zvítězili v evoluci tím, že si rozdělili práci. Zbytek obstarává chemie

Termiti dokážou stavět osmimetrové stavby a dělit si práci díky chemické komunikaci. Pozvání Veroniky Sedláčkové přijal Robert Hanus z ÚOCHB.
Ústav organické chemie a biochemie AV ČR
tag
share
more
Webináře LabRulezLCMS týden 18/2025
Článek | Webináře

Webináře LabRulezLCMS týden 18/2025

10 webinářů: LC-MS/MS a potraviny, Váhy, Proteome Discoverer SW, Elektrochemie, meření pH, xenotransplantáty, AI v Proteomice, HiPLEX-IHC Imaging, Data a proteiny, HPLC a USP 621.
LabRulez
tag
share
more
 

Mohlo by Vás zajímat

Analyzing 193 Veterinary Drug Residues in Livestock and Poultry Meat

Aplikace
| 2025 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Targeted LC-MS/MS detection of lipid impurities in lipid nanoparticles

Aplikace
| N/A | KNAUER
Instrumentace
HPLC, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
KNAUER, SCIEX
Zaměření
Farmaceutická analýza, Lipidomika

Choosing Appropriate Pore Size Columns for Size Exclusion Chromatography of Oligonucleotides

Aplikace
| 2025 | Agilent Technologies
Instrumentace
GPC/SEC, Spotřební materiál, LC kolony
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Farmaceutická analýza

Polysorbate Degradation Analysis with the AdvanceBio Surfactant Profiling HPLC Column

Příručky
| 2025 | Agilent Technologies
Instrumentace
Spotřební materiál, LC kolony
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Farmaceutická analýza

Simultaneous Analysis of Synthetic Colorants, Including Red No. 3, Using an Organic Silica Hybrid Core-Shell Column

Aplikace
| 2025 | Shimadzu
Instrumentace
Spotřební materiál, LC kolony, HPLC
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství
 

Podobné články

Shimadzu HPLC Blog: Retenční faktor (k)
Článek | Akademie

Shimadzu HPLC Blog: Retenční faktor (k)

Dnešní článek navazuje na předchozí díly a zaměřuje se na klíčový pojem retenčního faktoru (k), který pomáhá definovat, co znamená „adekvátní retence“ při vývoji chromatografické metody.
SHIMADZU Handels GmbH - organizační složka
tag
share
more
Metodický list 26 – Nazývejme program PT správně!
Článek | Akademie

Metodický list 26 – Nazývejme program PT správně!

Mezilaboratorní porovnání se používají přes 100 let. Leták objasňuje jejich terminologii, problémy se zavádějícími pojmy a důležitost harmonizace.
Eurachem-ČR
tag
share
more
Podcast CHEmic #51 – Termiti zvítězili v evoluci tím, že si rozdělili práci. Zbytek obstarává chemie
Video | Osobnosti

Podcast CHEmic #51 – Termiti zvítězili v evoluci tím, že si rozdělili práci. Zbytek obstarává chemie

Termiti dokážou stavět osmimetrové stavby a dělit si práci díky chemické komunikaci. Pozvání Veroniky Sedláčkové přijal Robert Hanus z ÚOCHB.
Ústav organické chemie a biochemie AV ČR
tag
share
more
Webináře LabRulezLCMS týden 18/2025
Článek | Webináře

Webináře LabRulezLCMS týden 18/2025

10 webinářů: LC-MS/MS a potraviny, Váhy, Proteome Discoverer SW, Elektrochemie, meření pH, xenotransplantáty, AI v Proteomice, HiPLEX-IHC Imaging, Data a proteiny, HPLC a USP 621.
LabRulez
tag
share
more
 

Mohlo by Vás zajímat

Analyzing 193 Veterinary Drug Residues in Livestock and Poultry Meat

Aplikace
| 2025 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Targeted LC-MS/MS detection of lipid impurities in lipid nanoparticles

Aplikace
| N/A | KNAUER
Instrumentace
HPLC, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
KNAUER, SCIEX
Zaměření
Farmaceutická analýza, Lipidomika

Choosing Appropriate Pore Size Columns for Size Exclusion Chromatography of Oligonucleotides

Aplikace
| 2025 | Agilent Technologies
Instrumentace
GPC/SEC, Spotřební materiál, LC kolony
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Farmaceutická analýza

Polysorbate Degradation Analysis with the AdvanceBio Surfactant Profiling HPLC Column

Příručky
| 2025 | Agilent Technologies
Instrumentace
Spotřební materiál, LC kolony
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Farmaceutická analýza

Simultaneous Analysis of Synthetic Colorants, Including Red No. 3, Using an Organic Silica Hybrid Core-Shell Column

Aplikace
| 2025 | Shimadzu
Instrumentace
Spotřební materiál, LC kolony, HPLC
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství
 

Podobné články

Shimadzu HPLC Blog: Retenční faktor (k)
Článek | Akademie

Shimadzu HPLC Blog: Retenční faktor (k)

Dnešní článek navazuje na předchozí díly a zaměřuje se na klíčový pojem retenčního faktoru (k), který pomáhá definovat, co znamená „adekvátní retence“ při vývoji chromatografické metody.
SHIMADZU Handels GmbH - organizační složka
tag
share
more
Metodický list 26 – Nazývejme program PT správně!
Článek | Akademie

Metodický list 26 – Nazývejme program PT správně!

Mezilaboratorní porovnání se používají přes 100 let. Leták objasňuje jejich terminologii, problémy se zavádějícími pojmy a důležitost harmonizace.
Eurachem-ČR
tag
share
more
Podcast CHEmic #51 – Termiti zvítězili v evoluci tím, že si rozdělili práci. Zbytek obstarává chemie
Video | Osobnosti

Podcast CHEmic #51 – Termiti zvítězili v evoluci tím, že si rozdělili práci. Zbytek obstarává chemie

Termiti dokážou stavět osmimetrové stavby a dělit si práci díky chemické komunikaci. Pozvání Veroniky Sedláčkové přijal Robert Hanus z ÚOCHB.
Ústav organické chemie a biochemie AV ČR
tag
share
more
Webináře LabRulezLCMS týden 18/2025
Článek | Webináře

Webináře LabRulezLCMS týden 18/2025

10 webinářů: LC-MS/MS a potraviny, Váhy, Proteome Discoverer SW, Elektrochemie, meření pH, xenotransplantáty, AI v Proteomice, HiPLEX-IHC Imaging, Data a proteiny, HPLC a USP 621.
LabRulez
tag
share
more
 

Mohlo by Vás zajímat

Analyzing 193 Veterinary Drug Residues in Livestock and Poultry Meat

Aplikace
| 2025 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Targeted LC-MS/MS detection of lipid impurities in lipid nanoparticles

Aplikace
| N/A | KNAUER
Instrumentace
HPLC, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
KNAUER, SCIEX
Zaměření
Farmaceutická analýza, Lipidomika

Choosing Appropriate Pore Size Columns for Size Exclusion Chromatography of Oligonucleotides

Aplikace
| 2025 | Agilent Technologies
Instrumentace
GPC/SEC, Spotřební materiál, LC kolony
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Farmaceutická analýza

Polysorbate Degradation Analysis with the AdvanceBio Surfactant Profiling HPLC Column

Příručky
| 2025 | Agilent Technologies
Instrumentace
Spotřební materiál, LC kolony
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Farmaceutická analýza

Simultaneous Analysis of Synthetic Colorants, Including Red No. 3, Using an Organic Silica Hybrid Core-Shell Column

Aplikace
| 2025 | Shimadzu
Instrumentace
Spotřební materiál, LC kolony, HPLC
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství
 

Podobné články

Shimadzu HPLC Blog: Retenční faktor (k)
Článek | Akademie

Shimadzu HPLC Blog: Retenční faktor (k)

Dnešní článek navazuje na předchozí díly a zaměřuje se na klíčový pojem retenčního faktoru (k), který pomáhá definovat, co znamená „adekvátní retence“ při vývoji chromatografické metody.
SHIMADZU Handels GmbH - organizační složka
tag
share
more
Metodický list 26 – Nazývejme program PT správně!
Článek | Akademie

Metodický list 26 – Nazývejme program PT správně!

Mezilaboratorní porovnání se používají přes 100 let. Leták objasňuje jejich terminologii, problémy se zavádějícími pojmy a důležitost harmonizace.
Eurachem-ČR
tag
share
more
Podcast CHEmic #51 – Termiti zvítězili v evoluci tím, že si rozdělili práci. Zbytek obstarává chemie
Video | Osobnosti

Podcast CHEmic #51 – Termiti zvítězili v evoluci tím, že si rozdělili práci. Zbytek obstarává chemie

Termiti dokážou stavět osmimetrové stavby a dělit si práci díky chemické komunikaci. Pozvání Veroniky Sedláčkové přijal Robert Hanus z ÚOCHB.
Ústav organické chemie a biochemie AV ČR
tag
share
more
Webináře LabRulezLCMS týden 18/2025
Článek | Webináře

Webináře LabRulezLCMS týden 18/2025

10 webinářů: LC-MS/MS a potraviny, Váhy, Proteome Discoverer SW, Elektrochemie, meření pH, xenotransplantáty, AI v Proteomice, HiPLEX-IHC Imaging, Data a proteiny, HPLC a USP 621.
LabRulez
tag
share
more
Další projekty
GCMS
ICPMS
Sledujte nás
Další informace
WebinářeO násKontaktujte násPodmínky užití
LabRulez s.r.o. Všechna práva vyhrazena. Obsah dostupný pod licencí CC BY-SA 4.0 Uveďte původ-Zachovejte licenci.