Tipy a triky v HPLC: Dvourozměrná chromatografie 2D HPLC

Hledání možnosti zvýšení píkové kapacity chromatografické kolony a tím i počtu analytů, které mohou být separovány v jediném nástřiku, vedlo ke vzniku vícerozměrné HPLC.

Při klasické „off-line“ HPLC se postupuje tak, že se sbírá určitá vybraná frakce ze semipreparativní kolony, které se následně analyzuje na druhé chromatografické koloně. Vybraná frakce se většinou sbírá do vialky a poté se nastřikuje nezávisle na druhou chromatografickou kolonu. Tento experiment vyžaduje dva nezávislé chromatografické systémy a případná automatizace této metody vyžaduje velmi složité technické zařízení.

Při on-line 2D chromatografii jsou přímo spojené dvě nebo více chromatografických kolon přímo spojeny přes přepínací ventil v jediném chromatografickém systému. V ideálním případě je snaha sbírat veškerý efluent z první kolony a nastřikovat jej na kolonu druhou. Bohužel v praxi se na druhou kolonu nanáší pouze efluent obsahující soluty, která nás zajímají.

Uspořádání 2D HPLC

Vícerozměrné (multidimensionální, 2D) separační techniky poskytují dramatické zvýšení píkové kapacity a celková píková kapacita je rovna píkové kapacitě v obou systémech, což vede k daleko vyššímu rozlišení. Pro píkovou kapacitu v jednom systému můžeme napsat:

HPLC.cz: Výpočet píkové kapacity jednoho chromatografického sytému

kde n je počet teoretických pater a kmax je kapacitní poměr posledního eluujícího píku. Píková kapacita roste s účinností kolony a s dobou analýzy a klesá s požadovaným vyšším rozlišením R₁,₂.

Při 2D HPLC musí být splněny dvě podmínky:

1. orthogonalita separačního mechanismu

2. účinnost separace získaná v jednom systému nemůže být snížena separací v systému druhém. (1)

Když jsou splněny obě podmínky, pak maximální celková píková kapacita PcTotal dvourozměrného chromatografického sytému je

HPLC.cz: Výpočet celkové píkové kapacity dvourozměrného chromatografického sytému

Bohužel primární kolona produkuje mnohem větší počet vzorků, než je sekundární kolona může zpracovat. V případě, že je průtok na primární koloně 1 ml/min a doba analýzy je 5 minut pak při nástřiku 50 µl na sekundární kolonu je pak nutné, aby sekundární kolona zpracovala 100 vzorků.

Jestliže bude tedy průtok a doba analýzy na obou kolonách podobná, pak bude vyžadována 100 sekundárních kolon, aby se dosáhlo tohoto zdánlivě jednoduchého úkolu. Zobecněno, počet sekundárních kolon roste s retenčním časem na primární koloně.

Dávkováním efluentu, který obsahuje pouze píky, které nás zajímají, se pak snižuje počet sekundárních kolon na jednu až dvě kolony.

Typický systém pro online 2D HPLC zahrnuje dva chromatografy (čerpadla, kolony, detektory, nástřiková zařízení a kapiláry, které spojují všechny moduly s přepínacími ventily) řízené počítačem.

Eluent z primární kolony prochází přes první detektor a potom přes smyčku přepínacího ventilu a to buď do odpadu nebo do druhého obvodu systému se sekundární kolonou. Přepnutí ventilu řídí počítač v okamžiku, kdy detektorem prochází pík solutu, který nás zajímá.

Přepínací ventil v tomto případě reprezentuje nástřik na sekundární kolonu namísto autosampleru. Při řízení přepínacího ventilu je nezbytné přesné časování přepínání ventilu ke kompenzaci časové prodlevy mezi detektorem a smyčkou (obrázek 1).

HPLC.cz: Obr. 1 Schéma 2D HPLC

Kompatibilta mobilních fází

Selektivita je při separaci komplexních směsí důležitý faktor a proto mohou být použity rozdílné chromatografické módy v obou dimenzích tak, abychom dosáhli co nejvyšší separace.

Bohužel pro každý chromatografický mód je charakteristické použití rozdílných mobilních fází, které nejsou zcela vždy kompatibilní. Jako příklad je možné uvést použití gelové permeační chromatografie jako chromatografický mód v primárním módu, kde se nejčastěji používá jako mobilní fáze tetrahydrofuran, který je dobře mísitelný s mobilními fázemi normální i reverzní fáze, které mohou být použity v sekundárním chromatografickém módu. Na druhou stranu, normální fáze použitá v prvním módu není kompatibilní s reverzní fází použité v módu druhém.

Pseudo 2D HPLC

Dvourozměrná HPLC s jednou chromatografickou kolonu zjednodušuje koncept vícerozměrné chromatografie zahrnující následné separace ve dvou rozdílných mobilních fázích. Jako příklad je možné uvést použití konvenční reverzní fáze C18, která se použije pro separaci nabitých a neutrálních malých organických molekul a peptidů.

V prvním módu, se gradient pH vodné mobilní fáze použije pro pozvolnou ionizaci nabitých organických molekul. Ve druhém módu se gradientem methanolu ve vodných pufrovaných mobilních fázích eluují neutrální hydrofobní molekuly , které se dosud zadržovaly na počátku chromatografické kolony během prvního kroku.

Tento typ eluce je obvykle řízen pouze změnou složení mobilní fáze, protože stacionární fáze zůstává stejná pro každý separační krok. Tento typ separace není pravá dvourozměrná chromatografie, protože vysokomolekulární látky nejsou separovány.